结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，现已成为全球癌症死亡的第二 大主因。西方发达国家和发展中国家结肠癌的发病率和死亡率都呈上升趋势 [1-2]，因此及时发现并对症治疗，延长病人生存期并有效控制结肠癌的发展具 有重要意义。临床上主要的治疗手段有手术、放/化疗及生物疗法。对于化疗 药物而言，5-氟尿°密咬（5-fluorouradl, 5-FU)仍为目前最主要和最广泛应用 的药物。由于普通口服制剂的吸收不规则，对胃肠刺激严重，5-FU的临床给 药形式以静脉注射为主[u]。静脉注射会产生较强的全身毒副作用，且病人的 顺应性差，影响治疗效果。因此将5-FU制成经口给药后避免在胃、十二指肠、 空肠和回肠前端释药，完整运送到回盲部后释放至结肠的给药体系，即口服 结肠定位释药系统（oral colon-specific drug delivery system, OCDDS ) [4-5]用于 结肠癌的化疗具有现实的临床实用价值。该系统可以直接将药物释放至结肠， 避免了药物在上消化道不必要的释放和吸收，达到提高结肠病灶部位药物浓 度，降低药物用量，减少全身吸收，减低药物潜在毒、副作用的目的，最终 提高了临床治疗效果。

吲咮美辛（Indomethacin, IDM)系非甾体类抗炎药（NSAIDs),临床上 用于风湿性疾病及多种关节炎的治疗。近年来大量的流行病学资料和实验研 究已证明IDM等NSAIDs可通过抑制环氧化酶-2 (C0X-2)等多种途径抑制 细胞增殖、诱导细胞凋亡，在一定程度上起到预防和治疗结肠癌的作用【6—9]。 然而NSAIDs对胃肠道的刺激和毒性反庭严重，限制了它们在结肠癌化学预 防中的长期应用。因此将NSAIDs制成OCDDS，乾向于结肠局部释药，可以 避免药物对上消化道的刺激，提高病灶部位的药物浓度，降低药物的全身毒 性，最终改善药物对结肠癌的防治效果。

目前制备OCDDS的方法有多种，但不外乎采用药剂学 (formulation-specifc)和化学（drug-specific)两种方法。根据释药机制可将 OCDDS分为以下三种主要类型：pH敏感型释药系统、时间依赖型释药系统 和酶促发型释药系统[1(M4]。

pH敏感型OCDDS:这类释药系统类似于经典的肠溶包衣制剂。即利用 整个胃肠道中小肠末端的pH值最高的特点[15-16],应用在特殊pH条件下溶解 或溶胀、容蚀的聚合物作为包衣材料，将药物制剂包衣，避免药物在上消化 道释放，达到将药物运送到小肠末端开始释放的目的。由于肠溶包衣材料性 能成熟、方便易得以及制备工艺简单，pH敏感型成为OCDDS中最简便易得 的一种类型。目前已上市的口服结肠制剂大多为这种类型，如治疗溃疡性肠 炎的Asacol®和Salofalc® ( 5-氨基水杨酸)；治疗克罗恩氏病的Budenofalk® 和Entocort® (布地奈德）。然而令人遗憾的是，由于小肠后端即回肠处的pH 值即在7-8,近端结肠由于大量的食物残法被消化为短链脂肪酸，pH值回 落到6.5左右[11’15]，而通常使用的丙烯酸树脂的溶解值为pH 6 (Eudrgit®L) 和pH7(Eudrgit®S/Eudrgit®FS30D),这将导致药物的提前释放。另外个体 间/个体内pH值的差异性以及病理状态下pH值的变化也使得单纯采用pH敏 感包衣实现药物的结肠递送变得不可靠。

时间依赖型OCDDS:根据口服制剂到达结肠所需要的时间，用适当的方 法延迟制剂的释药时间，即口服后约经5-6h开始释药，可达到定位于结肠释 药的目的，与pH敏感型不同，时间依赖型OCDDS不能通过单层包衣达到目 的，一般需采用情性/肠溶包衣与形成凝胶膨胀层或渗透泵等两种或多种原理 相结合的工艺方法才能实现延迟5-6h释药的目的[17_19]，制备工艺相对复杂， 影响释药部位的因素较多。

酶促发型OCDDS (生物降解型OCDDS):盲、结肠内存在多种胃和小 肠中不存在、由微菌群产生的酶，如偶氮降解酶、糖苷酶、葡萄苷酸酶、果 肢酶、葡聚糖酶等等[5’2()]，它们能专一地降解相应的物质，可作为理想的结肠 靶向释药机制。利用可被酶降解的物质，将药物制成前体药物或骨架/包衣制 剂，到达结肠后经酶解作用而释药的OCDDS称为酶促发型OCDDS。与胃肠 道的pH值及转运时间不同，结肠内存在的大量菌群具有位点特异性，是一 独立的释药促发机制，因此酶促发释药目前被认为是OCDDS中最可靠的一 种释药机制〇22]。常用的可生物降解材料中除偶氮聚合物外均为天然多糖类 物质，如脱乙酰壳聚糖、果肢、瓜尔胶、葡聚糖、菊粉、硫酸软骨素、环糊 精等[2347]。这类材料除了具有生物可降解性、生物相容性、溶胀性和可成膜 性的特点之外，它们来源丰富、价廉、安全无毒，被公认为是实现结肠靶向 最具实用价值的材料。然而多糖类物质的高亲水性，对药物的保护能力有限， 易造成药物的提前释放，并且多糖类物质遇水形成高粘度的溶液，限制了剂 型制备的种类，到目前为止国内外大多数研究停留在骨架片和压制包芯片的 制备123^29]。骨架片通过扩散/溶蚀机制释药，因此在胃和小肠内即有大量 的药物释出，无法实现有效的释药时滞。压制包芯片在包衣过程中使用较大 压力，形成非常紧密的包衣层，虽然可保护药物安全通过胃和小肠，但是进 入结肠后多糖衣层的水化速度慢，酶不易进入衣层发挥降解作用，最终导致 酶促发药物释放机制的灵敏度下降，药物在结肠内释放缓慢，且药物可能释 放不冗全。

因此，要实现有效的结肠定位释药通常不能依靠一种释药机制，往往需 几种机制共同作用，才能克服消化道的生理屏障，实现药物的结肠递送与释

放。

瓜尔股（guar gum, GG )是从广泛种植于印巴次大陆的豆科植物瓜

尔豆中提取得到的一种植物胶。其主要成分为半乳甘露聚糖，就其分子结构 来说是一种非离子多糖，主链由(l-4)-yS-D-甘露糖为单元连接而成，侧链由 单个a-D-半乳糖组成并以(1-6)键与主链相接，甘露糖/半乳糖的比例为2:1 [2〜21](结构见图1)。瓜尔肢遇水溶胀并形成粘性的胶体溶液，除了广泛用 做食品增稠剂外，可以作为粘合剂和阻滞剂用于制剂的研制。由于瓜尔胶的 胶凝作用可以阻滞药物自制剂中的释放，同时它可被盲/结肠中的细菌产生的 酶降解[3M1]，因此成为近年来OCDDS中研究较多的可生物降解材料之一 [29,32-34】。由于瓜尔胶遇水形成高粘度的股体溶液，使其在酶促型OCDDS中 的应用目前仅限于骨架片和压制包芯片的研究[23’29,33’35_38]。而小丸具有胃肠道 分散均匀，与肠粘膜接触面积大、转运时间受胃肠道生理状态影响小等优点， 被认为是目前口服结肠定位释药系统的最佳剂型[3941]。

因此本文以小丸为剂型，瓜尔胶为可生物降解的材料，5-氟尿嘧啶和吲 咮美辛为模型药，立足于最具结肠靶向特异性的酶促发释药机制，结合pH 敏感/时间依赖释药机制，通过流化床包衣技术分别研制了 pH敏感-酶促皮双 重控制OCDDS和时间依赖-酶促发双重控制OCDDS,考察它们的体内、外 释药行为，评价其结肠靶向性，以获得制备结肠靶向给药系统的可靠技术， 为临床治疗/预防结肠癌提供疗效确切、毒副作用低的5-氟尿嘧咬和吲咮美辛 的新剂型。并且，5-氟尿'癌咬和吲咮美辛作为水溶性药物和难溶性药物的代 表为其他药物的口服结肠定位释药系统的研究提供了指导和借鉴。

受胃肠道生理特点及材料固有特性的制约，依靠单一机制释药的OCDDS 往往在体内的结肠靶向有效性和重复性不佳[“5]。本章采用pH-酶双重促发机 制设计口服结肠定位释药小丸，原理如图1.1所示。分别以Eudragit FS30D 和瓜尔肢为外层pH敏感衣及内层酶敏感衣对载药丸芯进行双重包衣。外衣 膜Eudragit FS30D保护药物通过胃、十二指肠和空肠，到达回肠后在pH值 为7〜8的肠液中溶解（EudragitFS30D的溶解阈值为pl^7),内层瓜尔胶暴 露于肠液中。瓜尔胶在水溶性的环境中不断地吸水、溶胀，逐步在小丸表面 形成稠厚的凝胶层，这层凝胶层既减缓水分继续向内渗入同时也阻碍药物向 外渗出，因此可以在Eudragit FS30D溶解后继续保护药物不释放。当包被瓜 尔胶凝股层的小丸进入结肠后，结肠内微菌群产生的酶扩散进入凝胶层发挥 酶解作用，瓜尔肢被水解为短链寡糖，凝肢层逐渐松散并消失，位于丸芯的 药物层可以以更快的速度释出。

Pellet remains €nteric coatGuar gumDrug diffusion• Guar gum is degraded and drug

intact 1 dissolvesswellsbegins1 releases

1

proximaldistal (pH7.0〜7.5)ilecH^ecal junction

stomach small intestinej colon

Fig. 1.1 Schematics of the conceptual design of the pH-and enzyme-controlled colon-specific delivery

system (not to scale).

 

1.材料与仪器

1.材料

5_氟尿嘧啶(批号〇2〇%1)

聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30)

聚乙二醇（PEG4000)

羟丙曱纤维素（HPMC, 5cPa-s)

蔗糖丸芯（PF101, 710-850(im) 瓜尔胶

(规格分别为 900 ~ 1300cps、2600 5500cps)

肠溶型丙烯酸树脂水分散体 (Eudragit FS30D)

柠檬酸三乙酯（TEC)

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg)

5-溴尿嘧啶（5-BU,内标）

甲醇（色谱纯）

用于HPLC的试剂为色谱纯，盐酸、

分析纯

2.仪器

JGM-H50气流粉碎机

UV-2401PC型紫外分光光度计

BS210S电子天平

BS610S电子天平

85-2型恒温磁力搅拌器

微型流化包衣设备

GPCG1.1型流化包衣机

蓝森牌离心式单相交流鼓风机

DDB-320多功能电子蠕动泵

ZRS-8G智能溶出仪

S-520扫描电子显微镜

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪

南通制药总厂

国际特品（香港）有限公司 上海化学试剂采购供应站 上海Colorcon包衣技术有限公司 法国NP Pharm公司 法国Rhodia公司

~ 3100cps、4000 ~ 4500cps 和 5200 〜

德国degussa R6hm公司

美国Morflexs公司 Fluka Biochemika Sigma公司 Merck公司

磷酸二氢钾、氢氧化钠等其他试剂均为

华东理工大学 曰本岛津 Sartorius Sartorius

上海智威电器有限公司 自制

德国Glatt公司 浙江温岭市潘郎鼓成机厂 宁波石浦海天电子仪器厂 天津大学无线电厂 曰本Hitachi公司 美国安杰伦公司 

(G1322ADEGASSER, G1311A QuatPump, G1313A ALS, G1315B DAD )

XW-80型旋涡混合器上海超声波仪器厂

3.动物

Wistar大鼠，250±20g，清洁级复旦大学医学院实验动物科学部 Beagle犬，3，8.0±2.0 kg,普通级上海市新冈实验动物场

2.实验方法

1.体外分析方法的建立

1.15-FU小丸含量测定方法的确定

1.1,1小丸含药量测定波长的确定

参照中国药典，用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制一定浓度()的5-FU 溶液，于200 ~400nm范围内进行紫外扫描，确定检测波长。

1.1.2标准曲线的制备

精密称取5-FU100 mg，用pH7.4PBS溶解定容于100 ml量瓶。分别精密 吸取一定体积的溶液，作不同倍数的稀释，所得浓度分别为3、6、9、12、 15、18pg/ml，于所确定的波长处测定吸收度，以吸收度（A)对來度（C, pg/ml) 作线性回归，得标准曲线方程'。

1.1.3辅料干扰试验

称取处方量辅料于1〇〇1111量瓶中，加入0117.4?88适量，超声1〇111丨11后 定容。离心(3500rpm, 15min)、过滤，续滤液经50倍稀释后于200~400nm

波长范围内进行紫外扫描。

1.1.4回收率试验

精密称取40、50、60 mg 5-FU置于100ml量瓶中，再称取相当于一个剂 量的辅料加入到上述量瓶中，加PH7.4PBS适量，超声后定容。离心(3500rpm， 15min)、过滤，续滤液50倍稀释后于265nm处测定吸收值。以测得的量和 加入的量比较，计算回收率。

1.1.5 5-氟尿嘧啶吸收度稳定性试验（室温）

精密称取5-FU100 mg,用pH7.4PBS溶解并转移至100 ml量瓶中并定容 至刻度。分别吸取一定体积的溶液，作不同倍数的稀释，所得浓度分别为3、 9、15pg/ml,室温放置，分别于第Oh、6h、12h和24h在波长265nm处测 定吸收度。

1.1.6小丸含药量的测定

精密称取相当于含5-FU 50mg的小丸，在研钵中加适量的pH7.4PBS充 分研磨至完全溶解，转移至100ml量瓶中，加pH7.4PBS适量，超声10 min 后定容。离心(3500rpm, 15min)、过滤，续滤液用pH7.4PBS 50倍稀释，于 265nm处测定吸收度，代入标准曲线计算药物的浓度。

1.25-FU小丸体外释放度测定方法的确定

本文分别以 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作为模拟

胃、小肠中前段（十二直肠和空肠）、小肠后段（回肠）及结肠pH环境的释 放介质；含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS作为模拟在体结 肠酶环境的释放介质。因此考察37°C下5-FU在不同介质中的稳定性及酶和 其它辅料对测定的影响，分别建立4种释放介质中5-FU测定的标准曲线并考 察其回收率。

1.2.1四种释放介质中检测波长的确定

分别用 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 配制一定浓度（l〇ng/ml) 的5-FU溶液，于200 ~ 400nm范围内进行紫外扫描。

1.2.2释药标准曲线的制备

精密称取5-FU100mg，用上述介质溶解、转移至100ml量瓶中并定容至 刻度。精密吸取一定体积的溶液，稀释至3、6、9、12、15、18ng/ml，于所 确定的波长处测定吸收度，以吸收度（A)对浓度（C, pg/ml)作线性回归， 得标准曲线方程。

1.2.35-FU在四种释放介质中的稳定性考察（37°C )

方法同释药标准曲线的制备，在37°C水浴中分别于第0h、6h、12h、 20 h和24 h在波长265nm处测定吸收度。

1.2.4释放介质中的辅料干扰试验

称取处方量空白包衣小丸，装于转篮中，分别置于900ml恒温37±0.5°C 的4种释放介质中，转速为75rpm, 20 h后取样，样品经0.8 jim微孔滤膜过 滤后，在200〜400nm范围对释放液进行紫外扫描。

1.2.5释药回收率试验

精密称取5-FU 50 mg置于100ml量瓶中，再称取相当于一个剂量的辅料 加入到上述量瓶中，分别加入0.1MHC1、pH6.8、pH7.4和pH6.5PBS，超声 lOmin后定容。分别稀释至3、9、15ng/ml，于265nm处测定吸收值。以测 得的量和加入的量比较，计算回收率。

1.2.6半乳甘露糖苷酶（galactomannanase)对释放度测定的干扰试验

半乳甘露糖苷酶为瓜尔胶的水解酶，称取适量，用pH6.5 PBS配置成 0.0388 U/ml的酶溶液，在200 ~ 400nm范围内进行紫外扫描。

1.3肠内容物法模拟在体结肠环境体外释放度试验中5-FU测定方法一HPLC 法的确定

1.3.1色谱条件

色谱柱：DiamonsilTM-C18(4.6mmx250mm，5(im)

流动相：曱醇:7K=5:95 流速： 1.0 ml/min 检测波长：265 nm 柱温：30°C 进样量：20卩1

1.3.2样品处理方法

样品离心后（lOOOOrpm, lOmin)，上清经0.45(im的微孔滤膜过滤，续 滤液用纯水稀释10倍后，20W进样分析。

1.3.3标准曲线的制备

精密称取5-FU100 mg,用含4%大鼠盲肠内容物(新鲜制备)的pH6.8PBS (10000 rpm, 10 min离心后）溶解、转移至50ml量瓶中并定容至刻度，作 为储备液。精密吸取一定体积的储备液，不同倍数稀释后，來度（C)分别 为 0.5、1、10、50、100、200、300pg/ml。按样品处理方法操作，HPLC 法 测定，以药物峰面积（A)对浓度（C，pg/ml)作线性回归，得标准曲线方 程。

1.3.4回收率与精密度测定

精密吸取一定体积的储备液，稀释不同的倍数到浓度（C )分别为1、50、 200)tig/ml，按样品处理方法操作，以测得浓度对实际浓度之比计算回收率。

精密吸取一定体积的储备液，稀释不同的倍数到浓度（C)分别为1、50、

200pg/ml,按样品处理方法操作，并作色谱分析。一天内重复五次，统计测 定数据的相对标准偏差RSD，即为方法的天内精密度。连续五天重复操作， 统计测得数据的RSD，即为方法的天间精密度。

1.3.5检测限

用已知浓度的样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，按信噪比 S/N=3时相应浓度确定检测限。

2.载药小丸的制备 2.1药物的微粉化

采用水混悬液喷雾上药，为防止混悬液中的固体颗粒堵塞喷嘴，一般要 求固体颗粒的粒径<10^m,本研究用气流粉碎机对药物进行微粉化，显微镜 下观察药物的粒径范围为2~ 10啤。

2.2用流化床制备载药丸芯

用微型流化床预试空白丸芯混悬上药的处方和工艺后，用GPCG1.1型 Glatt流化床制备载药丸芯。将粘合剂PVP溶于水中（6%, W/V)，搅拌下将 微粉化的药物分散于其中制成混悬液，即可用于喷液上药。上药过程中需要 连续揽拌药物混悬液。载药丸芯的制备工艺如下：

微型流化床：空白丸芯10g,喷嘴直径0.5_，控制出口温度25-28°C, 喷液速率l.Oml/min,在固定的风量和雾化压力下进行喷液上药。

Glatt流化床：空白丸芯lOOOg，底喷法，喷嘴直径1mm，进风温度50°C, 物料温度35°C,流化风量97-103m3/h,喷雾压力1.5bar,喷液速率ll-13g/min。 上药结束后，继续流化干燥5min,接着包一层HPMC隔离衣，增重约为2% (W/W),以防止小丸在贮存过程中粘结，最终制得小丸约1495g。用筛析法 通过称重测定小丸的粒径分布，筛取18-24目的小丸用于包衣。

3.EudragitFS30D/瓜尔胶双重包衣小丸的制备、释药影响因素及体外评价

3.1瓜尔胶包衣小丸的制备及影响其释药的因素 3.1.1包衣液的配制

称取一定量的瓜尔胶，用适量的乙醇分散，搅拌下加入适量蒸馏水，最 终的包衣液为4%的瓜尔胶（W/V)在醇/水（1/4, V/V)体系中的混悬液。

3.1.2小丸包衣

将制备好的载药小丸10 g加到自制微型流化床中，喷嘴直径为0.8 mm, 控制出口温度为28±2°C，喷液速率为1.2ml/min,在固定的风量和雾化压力 下进行喷液包衣，直至达到预设的包衣增重（coat weight gain, CWG )。包衣 增重（％)=(包衣后丸重-包衣前丸重）/包衣前丸重xi〇〇%。包衣过程中需 要连续搅拌包衣液。小丸包衣完成后，将小丸置于60°C的烘箱中干燥6h。

3.1.3释放度试验

按中国药典2005版规定的第一法（转篮法）测定。称取适量包衣小丸（含 5-FU50mg)，装于转篮中，置于900ml恒温37±0.5°C的释放介质中，转速为 75rpm,定时取样5ml,同时补充等量同温的新鲜介质。样品经0.8 pm微孔 滤膜过滤后，续滤液经适当稀释后于265nm处测定吸收值，通过标准曲线计 算药物的累计释放百分率。

分别以 0.1mol/L HC1、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作为模拟胃、

小肠中前段（十二直肠和空肠)、小肠后段（回肠）及结肠pH环境的释放介 质[16-2(>]。为了评价结肠内微菌群对瓜尔胶的酶解作用，在pH6.5PBS中加入 半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)来模拟在体结肠环境[6-1G]。

3.1.4酶法与肠内容物法对瓜尔肢水解作用的比较

结肠内大量的菌群可以产生多种天然多糖的水解酶，其中包括半乳甘露 糖苷酶，它可以降解瓜尔胶成短链寡糖。通常使用两种体系即纯酶系统和肠 内容物系统来评价瓜尔胶对结肠内的微菌群的酶解敏感性。本研究分别采用 两种体系模拟在体结肠环境，进行瓜尔肢包衣小丸的释放度研究，并比较两 种系统的优、缺点。

3.1.4.1酶法[11_13]

加入不同量的半乳甘露聚糖酶至pH6.5PBS中，作为释放介质，进行瓜 尔肢包衣小丸的释放度试验。释放介质中酶的浓度分别为0.0024U/ml、 0.0097U/ml 和 0.0388U/ml。

3.1.4.2肠内容物法[6’14_16]

连续7天，每天以lml的2% (W/V )瓜尔胶水溶液对大鼠进行灌胃，诱 导大鼠盲肠内的细菌产生瓜尔肢水解酶。在释放度试验开始前30min，处死 大鼠，切开腹部分离盲肠，取出盲肠内容物后称重并迅速转移到一直通有氮 气的PH6.8PBS中，最终形成肠内容物浓度为4% (W/V)的磷酸盐缓冲溶液, 作为模拟结肠酶环境的释放介质进行释放度试验。由于结肠内的菌群为厌氧 菌，所以在整个试验过程中，释放介质均保持通氮状态。分别于预设的时间 取样lml,并补充同等体积通氮的新鲜介廣。样品处理按本章中试验方法下 的1.3.2项操作，并用HPLC法进行含量分析。

3.1.5影响释药的因素

瓜尔肢包衣层阻滞药物释放的原因在于瓜尔肢遇水形成稠厚的凝胶层， 凝胶层的粘稠度及厚度与瓜尔肢粘度、包衣增重密切相关。

3.1.5.1瓜尔胶粘度的影响

分别选用粘度为 900~ 1300cps、2600~3100cps、4000~4500cps、5200 〜 5500cps的瓜尔肢对栽药丸芯进行包衣，考察同一包衣增重下瓜尔胶的粘度对 小丸释放度的影响。

3.1.5.2瓜尔肢包衣增重的影响

考察同一粘度的瓜尔胶不同包衣增重小丸的释放度。

3.1.5.3释药介质pH的影响

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 四种释放介质对

GG包衣小丸释放度的影响。

3.1.5_4瓜尔胶水解酶的影响

考察瓜尔胶包衣小丸在含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS

中的释药^亍为。

3.2Eudragit FS30D包衣小丸的制备及影响其释药的因素

制备EudragitFS30D包衣小丸，考察影响小丸释药的因素，确定最佳包 衣处方及工艺。在此后EudragitFS30D/瓜尔股双重包衣小丸体内、外释药行 为的评价中，均以Eudragit FS30D包衣小丸为参照制剂。 3.2.1包衣液的配制

称取一定量的Eudragit FS30D (固含物浓度为30% )，加水稀释至固含物 的浓度为10%，作为pH敏感型包衣液。

3.2.2小丸包衣

将制备好的载药小丸10g加到自制微型流化床中，喷嘴直後0.5mm，控 制出口温度24±2°C，喷液速率0.8ml/min，在固定的风量和雾化压力下进行 喷液包衣，直至达到预设的包衣增重。包衣结束包后，小丸在流化床内继续 流化5min。

3.2.3包衣小丸的热处理

小丸包衣完成后，将小丸置于恒温40°C的烘箱中进行2 h的热处理，热 处理过程中间隔一段时间需翻动小丸，以使受热均匀，防止粘连。

3.2.4释放度试验

转篮法测定，余下操作同3.1.3项下所述。分别以O.lmol/L HC1 (2h)、 pH6.8PBS(2h)、pH7.4PBS(lh)作为模拟胃、小肠中前段（十二直肠和空肠） 及小肠后段（回肠）pH环境的释放介盾。每次变换介廣在5min之内完成。

3.2.5影响释药的因素

3.2.5.1增塑剂的影响

Eudragit FS30D推荐使用的增塑剂为杵橡酸三乙酯（TEC )，用量为2-5% 或可不使用[17],因此考察不使用TEC和用量为5%时小丸的释药行为。

3.2.5.2包衣增重的影响

考察包衣增重分别为20%、30%和40%时小丸的释药行为。

3.2.5.3热处理时间的影响

40°C分别对包衣小丸进行0、2、6、12h的热处理后进行药物释放度的测 定，考察热处理时间对小丸释药行为的影响。

3.3Eudragit FS30D/瓜尔胶双重包衣小丸的制备及体外释药评价 3.3.1小丸的包衣

依次按本章实验方法中3.1.2和3.2.2项下的操作对载药丸芯进行瓜尔胶 内层包衣及FS30D外层包衣，包衣增重分别为580%和30%。

3.3.2释放度试验

转篮法测定。余下操作同3.1.3项下所述。分别以pH连续变化的介质即 0.1mol/LHCl(2h)、pH6.8PBS(2h)、pH7.4PBS(lh)和 pH6.5PBS(12h)作为释放 介质，模拟胃、小肠中前段（十二直肠和空肠）、小肠后段（回肠）及结肠的 pH环境;pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.0097U/ml)来模拟在体结肠的

酶解环境。

4.小丸释放度评价方法

比较两条释放曲线差异性的方法有多种，如方差分析法（ANOVA-based approaches)，非模型法（model-independent approaches)及模型依赖法 (model-dependent approaches )。其中非模型法的f2相似因子法能灵敏、准确 地反映溶出或释放曲线之间的差异[18—19]。计算的公式如下：

>n]~°.5]

/2=501og< \ + \ln^YjVt{R,-T)2xl〇〇l

其中f2:相似因子

Rt: t时间对照制剂的累积释药百分率

Tt: t时间试验制剂的累积释药百分率

n:释放度试验取样点数

Wt:权重因子（所有数据点同等对待时Wt=1.0 )

该方程是方差总和的对数转换形式，f2值可以灵敏地反映出两者体外释 放度差异。f2值在50 ~ 100之间表明两条曲线相似。f2越大，表明体外释放 度越接近。当f2=100时，两者具有完全相同的释放度；f2值<50,两者释放度 则存在明显差异，随f2减小而差异增大，当f2趋近于0时，则释放度差异最

大。

本文均采用込相似因子法评价释放度的差异性。

5.扫描电镜观察

用扫描电键观察FS30D/GG双层包衣小丸的剖面结构及GG包衣小丸释 放前后的表面形态。观察前样品喷金，以使其具有导电性。

6.体内分析方法的建立

5-FU是临床上常用的抗肿瘤药物，对消化道癌和其他实体瘤均有良好的 疗效。测定5-FU血药浓度的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)。本文参考 文献报道的分析方法[2G_21]，采用下述的反相高效液相色谱法测定犬口服5-FU 制剂后的血药浓度。

6.1色谱条件

色谱柱：DiamonsilTM-C18(4.6mm><250mm, 5|im)

流动相：甲醇：7^=5: 95 流•速：1.0 ml/min

检测波长：265 nm 柱温：30°C

内标：5-BU (10|ag/ml)

进样量：20(^1

记录5-FU与5-BU的峰面积比为响应参数，内标法定量。

6.2血浆样品处理方法

精密吸取犬血浆50〇nl，5-BU(10|ag/ml)10〇W于lSml离心管中加入5ml乙 酸乙酯，旋涡混合lOmin，离心15min(3500rpm)，取上层有机层于5ml洁净离 心管中，于40°C水浴中用氮气吹干，残渣用lOOjil流动相溶解，离心后取2〇nl

进样分析。

6.3血药浓度标准曲线的建立

精密吸取犬血浆5004,加入5-FU标准溶液（100^1),使浓度分别为20, 50，100, 200, 400，600，800ng/ml，加入内标的方法同上，按血浆样品处理 方法操作，以HPLC法测定，以样品峰面积与内标峰面积的比值R( A5.FU/A5.BU ) 对样品浓度（C5_FU)作线性回归，求回归方程。

6.4血药浓度分析方法的评价

6.4.1方法精密度

取空白血浆500|nl数份，加入5-FU标准溶液，使浓度分别为50、200、 600ng/ml,加入100^1内标溶液，按血浆处理方法操作并作色谱分析。一天 内重复五次，统计测定数据的相对标准偏差RSD，即为方法的天内精密度。 连续五天重复操作，统计测得数据的RSD,即为方法的天间精密度。

6.4.2方法回收率

取空白血浆500W数份，加入5-FU标准溶液，使浓度分别为50、200、 600ng/ml，加入100^1内标溶液，每一浓度配置五份样品，按血浆处理方法 操作并作色谱分析，以测得的浓度对实际浓度之比计算方法回收率， 6.4.3提取回收率

取空白血浆5004数份，加入5-FU标准溶液，使浓度分别为50、200、 600ng/ml,每一浓度配置五份样品，按血浆处理方法操作并作色谱分析，分 别与同浓度的5-FU标准溶液直接进样的峰面积做比较，计算提取回收率。 6.4.4检测限

用已知浓度的样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，按信噪 比S/N=3时相应浓度确定检测限。

6.4.5最低定量限

样品中被测物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确 度和精密度（兄SD£20 % ,这20 %，测定偏差E = (C *i-CU)/C标><1〇〇 % )。

7.Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣小丸在犬体内的药物动力学研究

口服OCDDS后进行药物动力学研究，根据不同时间下的血药浓度，可 计算出制剂的T^、C_和AUC,更为关键的是可以了解该制剂的体内吸收 时滞，以此估计吸收是否在到达结肠后开始，即通过药物动力学试验可以评 价制剂的结肠把向性。

7.1研究对象

Beagle 犬 5 只，8.0±2.0kg,普通级 7.2试验制剂与参比制剂

受试制剂：FS30D/GG双重包衣小丸：FS30D层包衣增重30%, GG层包衣 增重580%。

参比制剂：栽药小丸

FS30D包衣小丸，包衣增重30%。

7.3试验设计 服药方法：

采用自身对照交叉试验设计，洗净期为1周。5只犬，禁食过夜（18h), 次日清晨空腹给药(含5-FU 50mg),用10ml水灌胃。由于本章Eudragit FS30D/ 瓜尔肢双重包衣小丸和后文第三章中瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸的犬体内 药物动力学研究均以5-FU栽药小丸为参比制剂，因此两部分药物动力学试验 一起完成。服药方案见表1.1。

血样采集：

于服药前后设定的时间从前肢静脉取血1.2ml，置于肝素钠离心管中， 8000rpm离心lOmin，取上清血浆于-20°C冷冻保存，待分析。

服用载药小丸的取样时间点：5min、15min、30min、45min、lh、1.5h、 2h、 3h、 4h、 5h、 7h、 9h。

服用FS30D包衣小丸的取样时间点：lh. 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、

10h、 12h、 24h

服用FS30D/GG双重包衣小丸的取样时间点：lh、2h、3h、4h、5h、6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h

样品分析方法：

用本文建立的HPLC法测定血浆中的5-FU浓度。

7.4数据处理

直接读取(：_和Tmax，并用t检验法对两参数进行方差分析（其中Cmax 经对数转换）。

Tab 1.1 Design of administration method of subjects receiving four fonnulations.

SubjectPhase of administration

IiiHIIV

1ABcD

2BCDA

3CDAB

4DABC

5ACBD

A:uncoated pelletsB: FS30D coated pellets

C: FS30D/GG doubble coated pellets D: GG-EC mixed coated pellets 三.结果与讨论 i.体外分析方法的评价 1.1 5-FU小丸含量测定分析方法的评价 1.1.1检测波长的确立

紫外扫描图谱（图1.2)表明在pH7.4PBS中5-FU的最大吸收波长为 265nm,因此选择265nm作为小丸含量测定的波长。

U.2含量测定标准曲线

在pH7.4的PBS中，5-FU在3 ~ 18pg/ml的范围内，吸收度和浓度的线 性良好，标准曲线方程为：A=0.0482C-0.0027 (r-0.9999)

1.1.3辅料干扰试验

图1.3表明辅料在波长265nm处对主药的测定无吸收干扰峰（A=0.005 )。

Fig. 1.2 The ultraviolet spectrum of excipient of pellets in pH7.4PBS. 1.1.4回收率试验 结果见表1.2

Tab 1,2 Accuracy of 5-fluorouracil in pH7.4PBS.

Cadded (Hg/ml)CdetectedAccuracy

(%)Mean ± SDRSD (%)

88.15±0.14101.88

1010.16 士 0,14101.60100.99± 1.301.28

1211.94±0.1299.50

 

选取小丸含量测定标准曲线上高、中、低三个浓度，分别于不同的时间 测定吸收度。结果见表1.3。表明5-FU在pH7.4PBS中24h内稳定。

Tabl .3 Absorbance of 5-fluorouracil in pH7.4PBS for 24h (n=3).

5-FUAbsorbanceMeanSD

(Hg/ml)Oh6h12 h24 h

30.1410.1440.1470.1460.1450.003

90.4320.4340.4460.4430.4390.007

150.7200.7250.7380.7370.7300.009

1.25-FU小丸体外释放度测定方法的评价 1.2.1四种释放介质中检测波长的确定

由图 1.4 可知 5-FU 在 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 四种释放

介质中的紫外扫描图谱无区别，最大吸收波长均为265nm。

1.2.2释药标准曲线

四种释放介质中，5-FU吸收度和浓度的线性曲线方程分别为： 0.1MHC1A=0.0535C+0.0013 (r-0.9999) 浓度范围：3 ~ 18pg/ml

浓度范围：3 ~ 18|ug/ml 浓度范围：3 ~ 18(ig/ml 浓度.范围：3 ~ 18jxg/ml

pH6.8PBSA=0.0530C+〇.〇〇75 (t-0.9999)

pH6.5PBSA-0.0541C+0.0024 (r^l.OOOO)

pH7.4PBSA=0.0482C-0.0027 (r=0.9999)

37°C水浴下不同时间5-FU在四种释放介质■中的吸收值见表1.4。

Tabl.4 Absorbance of 5-fluorouracil in different media at different time (n=3).

0.1MHC1

5-FUAbsorbanceMean土 SD

(Hg/ml)Oh6h12 h

30.1630.1650.1600.163±0.001

90.4850.4830.4870.485 土 0.001

150.8000.8030.8060.803土 0.000

pH6.8PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(Hg/ml)Oh6h20 h

30.1700.1680.1670.168 士 0.002

90.4790.4780.4770.478土0.001

150.8060.8050.8020.804土 0.002

pH6.5PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(fig/ml)Oh6h12h24 h

30.1660.1680.1690.1680.168 土 0.001

90.4870.4880.4860.4870.488土 0.001

150.8160.8130.8140.8050.812士0.005

pH7.4PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(|ag/ml)Oh6h12h24 h

30.1410.1470.1470.1460.145 土 0.003

90.4320.4340.4360.4360.432土 0.002

150.7200.7220.7180.7230.721 士 0.002

表明5-FU在体外释放度试验过程中稳定性良好，分析方法有效可行。

1.2.4释放介质中的辅料千扰试验

由图1.5可知辅料在四种释放介质中基本无千扰。

Figl .5 The ultraviolet spectra of excipient in different dissolution media(0.1M HC1, pH6.8,

pH7.4 和 pH6.5 PBS).

1.2.5释药回收率

四种释放介质中的释药回收率见表1.5，回收率均在98 ~ 103%之间，符

合要求。

Tab 1.5 Accuracy of 5-fluorouracil in different dissolution media.

0.1MHC1

Cadded (Hg/ml)Cdetected (f^§/ml)Recovery (%)Mean 土 SDRSD (%)

33.11 土 0.10103.67

99.20 土 0.07102.22102.92± 0.730.71

1515.29±1.16102.87

pH6.8PBS

Cadded (|ig/ml)CrfetectedAccuracy (%)Meari 士 SDRSD (%)

33.06 士 0.04101.92

98.84 士 0.0998.07100.06土 1.931.93

1515.05±0.09101.19

pH6.5PBS

Cadded (l^g/ml)C detectedAccuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

33.13±0.17104.33

99.16±0"09101.78102.57士 1.531.48

1515_24 土 0.09101.60

 

Cadded (^g/ml)CdetectedAccuracy (%)Mean 土 SDRSD(%)

33.06 士 0.10102.00

99.12±0.14101.33100.82± 1.501,49

1514.87 士 0.1499.13

1.2.6半乳甘露糖苷酶在pH6_5 PBS中对释放度测定的千扰试验

由图1.6可知该酶在波长265nm处对主药的测定无吸收干扰峰(A=0.009 )。

Figl.6 The ultraviolet spectrum of galactomannanase in pH6.5PBS.

1.3肠内容物法模拟在体结肠环境的体外释放度中5-FU测定方法——HPLC 方法的评价 1.3.1方法的专属性

5-FU的HPLC图谱见图1.7。由图可知在建立的色谱条件下，5-FU的保 留时间为6.8min，释放介质对药物的测定无干扰。

5-FU 标准曲线方程为 A=6.0423C+4.4779 (r=0.9999),浓度在 0.5~ 300|_ig/ml范围内线性关系良好。

1.3.3回收率和精密度

5-FU在肠内容物法模拟结肠体内环境的释放度试验中的回收率见表1.6。 测定方法的日内和日间精密度见表1.7。结果表明，所建立的分析方法准确.

可靠。

Tabl .6 Accuracy of the determination of 5-fluarouracil in the dissolution media containing rat caecal

contents (n=5).

AddedDetcted

〇g/ml)Accuracy

(%)MeaniSD

(%)RSD

(%)

11.02土0.01102.00

5-FU5049.78土 1.0298.1699.75土 2.002.00

,200198.17 土 2.6799.09

Tab 1.7 Precision of the determination of 5-fluorouracil in rat caecal content-based dissolution test

(n=5).

Added (^ig/ml)Detcted (ng/ml)RSD (%)

t1,01 士0.032.97

With in-day5049.88土 1.252.51

200203.67士 2.561.27

10.97 士 0.022.06

Between-day5051.01 土 1.202.35

200198.37土 3.211.62

1.3.4检册j I1艮

检测限为0.25|iig/ml。

2.载药小丸的评价

制备药物小丸的传统方法是滚动成丸法，但该法的药物损失大，且小丸 粒度分布不均。目前国内外常采用的方法之一是挤出-滚圆法[22_24]，但该法至 少需要挤压机和滚圆机两台机器方能完成造丸过程，且操作繁琐，投料量相 对较大。采用流化床对空白丸芯喷液上药制备载药小丸，只要空白丸芯粒径

均匀，就可得到粒径分布集中的小丸，并且上药效率高。本研究使用粒径范 围在710-850叫1 (20~24目）的空白丸芯，经Glatt流化床上药后，上药效 率达92.40% (上药效率（％ )=药物的实际含量/药物的理论含量x 1 〇〇% )，粒 径范围在18-24目的小丸占99.4% (图1.8)，小丸的载药量为28.23%。本 文第一章与第三章的研究均采用同一批载药丸芯。

测定载药小丸在不同介质中的溶出度，结果见图1.9,栽药小丸在各介质 中均能迅速溶出，5min内的溶出量均大于95%,因此载药丸芯不会成为阻滞

释药的因素。

o o o o

8 6 4 2 %£S-5M

100， 93 4

<2424-2020-18>18

Size range of pellets (mesh)

Fig. 1.8 Size distribution of uncoated pellets of 5-fluorouracil. 100 -rm -—■ i：

-A—0.1MHCI pH6.5PBS —pH6.8PBS l-pH7,4PBS

0102030

Time ( min)

Fig. 1.9 Dissolution behavior of uncoated pellets of 5-fluorouracil.

3.Eudragit FS30D/瓜尔胶双重包衣小丸的评价

3.1瓜尔胶包衣小丸的评价

3.1.1包衣液的配制及包衣小丸的制备

瓜尔胶在水中形成粘稍的胶体溶液，粘度过大和流动性不佳使得它在小 丸包衣中无法通过端动泵和空气压缩泵顺利喷出，并且喷液后小丸表面不易 干燥易发生粘连。为了将瓜尔肢应用于小丸剂（结肠靶向的最佳剂型）的包 衣，尝试不同的方法配制包衣液以降低浆料粘度：1、降低瓜尔肢容液的浓度 直到具有适宜粘度以适用于包衣。2、以PVP的乙醇溶液作为粘合剂将瓜尔胶 分散于其中。3、选择适宜的瓜尔胶浓度及醇/水比例，将瓜尔胶混悬于水/醇 系统中，形成具有适当浓度及粘度的包衣液。结果表明：方法1、对于粘度为 5200~5500cps的瓜尔胶而言，其水溶液的來度要50.25%时，包衣液的粘度才 足够小到可以进行喷雾包衣操作，但如此低的浓度将导致包衣时间过长。方 法2、瓜尔胶分散于PVP的乙醇溶液中，其包裹于载药丸芯上的能力完全依赖 于PVP醇溶液的粘度，喷液过程中瓜尔胶易与PVP溶液分离，被干燥成粉， 不能有效地包覆于小丸表面，此法的包衣效率很低，仅有25.60%。方法3、利 用瓜尔胶不溶于乙醇，遇水则形成粘性胶体的性质，通过加入适量的乙醇， 降低包衣液的粘度。保留下来的粘性既足够小，使包衣液可顺利喷出；同时 包衣液的粘附力也足够大，保证瓜尔胶可以较高的效率包覆于载药丸芯。本 文最终采用方法3,配置4%的瓜尔胶（W/W)的醇/水（1/4, V/V)混悬液作 为包衣液，在自制流化床中对栽药丸芯进行喷液包衣，包衣效率为75.81±2.13 % ( RSD=2.25%, n=3 )8

由于包衣液为瓜尔胶的混悬液而非溶液，所以喷雾包衣后形成的衣层并 非连续的衣膜，而是瓜尔胶颗粒的堆积。根据近年来国外出现的干粉包衣的 原理[2M8]，当包衣材料粒子的粒径小于10[mi以下时，可通过加大增塑剂的用 量、升高包衣操作温度，升高热处理温度及延长热处理时间等工艺手段促进 衣膜形成。但是瓜尔胶经3次气流粉碎后，粒径仍然在lOO^m左右，无法通过 加剧包衣操作及热处理条件来促成衣膜的形成。因此本文没有考察增塑剂的 种类及用量对瓜尔胶包衣小丸释放度的影响。包衣结束后，小丸在60°C的烘 箱干燥6 h，也仅是为了除去残留的水分。本文最终选用粒径尽可能小（300 目）的瓜尔胶作为包衣材料，以使包衣后瓜尔胶可以紧密堆积在小丸表面形 成致密均匀的衣层（见图1.19B)。

3.1.2酶法与肠内容物法对瓜尔胶水解作用的比较

为了评价以瓜尔股为载体的给药系统的酶促发释药机制，本文根据文献 报道的方法分别采用加酶（半乳甘露糖苷酶）及肠内容物的方法进行瓜尔胶 包衣小丸的释放度考察，结果见图1.10。结果表明，不同浓度的酶和4%的肠 内容物均可以加快药物的释放，酶浓度越高药物释放越快，当酶浓度达到 0.0097U/ml时与4%的肠内容物的酶促释药效果相当。因肠内容物法需要提前 诱导动物产生相关酶、肠内容物制备及释放度试验全程需通氮、并且样品需 采用HPLC法分析，相比之下酶法具有操作简便，样品分析简单迅速的优势,

故本文以后的研究中均采用酶法（(K00968U/ml，pH6.5PBS)来模拟在体结肠

一with galactomannanse(0.0024U/mI) — with 4% rat caeca! content

的酶环境。

0123456789101112

Time (h)

Fig. 1 • U) Release profiles of 5-fluorouracil from guar gum coated pellets in the absence and presence of various concentrations galactomannanase in pH6.5 phosphate buffer and in presence of 4% rat

caecal contents in pH6.8 phosphate buffer.

3.1.3影响释药的因素 3.1.3.1瓜尔肢粘度的影响

包被在小丸上的瓜尔胶遇水形成凝胶层，水分逐渐向丸芯渗入，经过一 定时间后到达小丸内部，润湿载药丸芯，药物通过瓜尔胶凝胶层逐渐释放到 介质中^药物从载药层释放的快慢与包衣层的性质密切相关。本文分别选用 枯度为 900 ~ 1300cps、2600 ~ 3100cps、4000 ~ 4500cps 和 5200 ~ 5500cps 的 瓜尔胶对载药小丸包衣，包衣增重均在550%左右。各种枯度的瓜尔胶包衣小 丸的释放度结果见图1.11。瓜尔胶对药物释放的阻碍作用，随着瓜尔胶粘度 的增大而增大。以T1()(药物释放10%所需的时间）作为参数来评价瓜尔肢衣 层阻滞药物释放的能力，上述4种枯度的瓜尔胶包衣小丸的T1Q分别为5 min、 20 min、40 min和60 min。在本文以后的研究中均采用枯度为5200 ~ 5500cps 的瓜尔肢。

0123456789101112

Time (h)

Fig. 1.11 Release profiles of 5-fluorouracil from pellets coated with guar gum of different viscosity (about 550% coat weight gain) in pH6.5 phosphate buffer.

3.1.3.2瓜尔胶包衣增重的影响

随着瓜尔胶包衣层厚度的增加，衣层阻碍药物释放的能力增强。从图1.12 可以看出当包衣增重达到580%时，药物lh的累计释放量为9.08%, 12h的 释药量接近100°/〇。与载药丸芯（图1.9)相比瓜尔胶衣层可以显著延缓5-FU

的释放。

3.1.3.3释放介质pH的影响

瓜尔胶包衣小丸在不同介质中的释放曲线见图1.13。可以看到药物的释 放速率与介质的pH值无关，四条释放曲线的f2均大于70，这与药物和瓜尔 股的性质有关，5-FU为水溶性药物，在四种介质中的溶解度均在18mg/ml 左右，而瓜尔胶为非离子型多糖，在pH<10范围内，它遇水形成粘稠胶体 的能力与pH值无关[291。 

pH6‘5PBS

s— pH7.4PBS pH6.8PBS 0.1MHCI

02468101214

T ime (h)

Fig. 1.13 Release profiles of 5-fluorouracil from guar gum coated pellets in different dissolution

media.

3.1.3.4瓜尔胶水解酶的影响

图1.14表明，半乳甘露糖苷酶可以引发瓜尔胶的降解，与对照组相比， 在含有半乳甘露糖苷酶的介质中，5-FU可以更为迅速地从小丸中释出。两条 释放曲线的色为32,00，差异明显，

3.2Eudragit FS30D包衣小丸的评价

用于口服结肠定位释药系统的pH敏感材料主要为丙烯酸树脂，其中 Eudragit S100和EudragitFS30D以其在大于pH 7溶液中溶解的特性，备受研 究者的青睐。近年来大多数研究均采用EudragitSlOO,它既可用于有机溶剂 包衣也可采取水性包衣，但须自行配制水分散体。由于Eudragit S100和 

EudragitFS30D的组成及制备工艺不同，它们在实际应用中的用法不尽相同。 EudragitSlOO的玻璃转化温度较高，在进行水性包衣时需加入较多的增塑剂 才能形成连续紧密的衣膜。以增塑效果最好的柠橡酸三乙酯为例，当柠檬酸 三乙酯用量达到40-50°/。，才能形成完好的衣膜。而对于EudragitFS30D而言， 商品本身已为水分散体，加水稀释后即可用于包衣。并且EudragitFS30D的 最低成膜温度很低仅为14°C,玻璃转化温度为48°C，因此包衣操作的溫度也 较低在30°C左右即可。由于EudragitFS30D的成膜性好，尽管它为水分散体， 但可以不加或最多加入2-5%梓檬酸三乙酯作为增塑剂。考虑到包衣操作的方 便性，本研究采用EudragitFS30D作为pH敏感包衣材料。

Eudragit FS30D是固含物为30%的曱基丙烯酸、丙烯酸甲酯和曱基丙烯 酸曱酯（1:1:1)共聚物的水分散体，其溶解阈值为pH27。FS30D包衣液的 配制简单，加水稀释至固含物为10%即可用于包衣。因此仅考察增塑剂、包 衣增重及热处理时间对FS30D包衣小丸释放度的影响。

3.2.1增塑剂的影响

选用产品推荐的柠檬酸三乙酯为增塑剂，用量分别为5%和0%时小丸（包 衣增重为20%)在pH值梯度变化的释放介质中的释药行为，结果见图1.15。 两条释放曲线重合，^为93.20，因此在以后的包衣液中均不加增塑剂。

o o o o

0 8 6 4

-■— without TEC -A— with TEC

3.2.2包衣增重的影响

制备包衣增重为19.79%, 31.00%, 39.80%的EudragitFS30D包衣小丸， 基于瓜尔胶包衣的口服结肠定位释药系统，分别考察它们在0.1mol/L HC1、pH6.8PBS的释药行为（图1.16)及梯度pH 介质中(模拟体内胃肠道的pH环境)的释药行为（图1.17)。从图1.17可以看 出，包衣增重不同的3种小丸在最初的4 h，即2 h 0.1mol/L HC1及2 h

100

80

3

3 60

u

5 40

•FS30D19.79%

-FS30D31.00%

-FS30D39.80%

20

o o o o

8 6 4 2 paseufaj }uauJv&

2

Time (h)

10

Time(h)

pH6.8PBS中均不释药。而当释放介质更换为pH 7.4PBS后，药物在0.5 h时 的累计释放量均已达到97%。图1.16A、B进一步表明了 3种包衣增重的 Eudragit FS30D 衣膜在 O.lmol/L HC1 及 pH6.8PBS 中耐受情况。在 O.lmol/L HC1中，Eudragit FS30D衣膜至少可以耐受8 h, 12 h的累计释放量也仅达到 5 %左右。在pH6.8PBS中，Eudragit FS30D衣膜可以保护药物不释放至少8 h, 而在8h之后，随着衣膜厚度的减小，药物的释放量增加，但对于增重31.00 %和39.80 %的包衣小丸而言，在12h的累计释放量也仅达到5 %左右。

Fig. 1.16 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets (A) in O.lmol/L HC1, 12h; (B)

100

o o o o

8 6 4 2

pdsBwPJ ISUJ3Q,

■FS30DI9.79%

-FSJ0D31.00%

-FS30D39.80%

in pH6.8 PBS, 12h.

0123456

Time (h)

Fig. 1.17 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh).

以上试验结果可以看出，Eudragit FS30D作为一种pH敏感包衣材料（pH 阈值为7，即在pH>7的环境下容解）对环境的pH的响应很灵敏，它可以保 护药物在低于其溶解阈值以下的pH环境不释放，而在高于溶解阈值的pH环 境中衣膜快速容解，药物迅速释出。在本文以后的试验中，固定Eudragit FS30D包衣增重在30°/<u

于40°C分别对包衣增重为30%的小丸进行0、2、6和12 h的热处理后 进行药物释放度的测定，结果见图1.18。未作热处理的包衣小丸4h的释药量 在8%左右，而热处理2h、6h和12h后小丸的释放曲线基本重合，4h的累计 释药量均小于1%,表明40。(：下热处理2h即可使膜完全愈合。因此如无特殊 说明，本文中的EudragitFS30D包衣小丸均采用2h的热处理工艺。

Time (h)

Fig. 1.18 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets with different thermal curing time in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh).

3.3Eudragh FS30D/瓜尔肢双重包衣小丸的性状及体外释药评价

图1.19A为EudragitFS30D/瓜尔胶双重包衣小丸在电镜下的剖面图。从 图中可以看到载药层致密均匀；Eudragit FS30D衣层为光滑、连续的衣膜， 相比之下瓜尔胶衣层略显疏松且呈不连续状态，这与瓜尔胶和Eudragit FS30D衣层的性质密切相关，前者仅为瓜尔胶颗粒的堆积，而后者则形成了 完整、连续的衣膜。

outer enteric coat^. (Eudragit FS30D)

Inner coat (guar guin)^

drug-loaded layer♦ Inert nonpareil ♦

Fig. 1.19 Scanning electron micrographs of the cross-section of the pellet coated with Eudragit FS30D and guar gum (A) and the surface of guar gum-coated pellet (without outer enteric coating) before (B) and during (C) release test at a magnification of 100 folds.

r

00

o o o o

8 6 4 2 P3SSPJ lu9oJ<s>a.

0246810121416

Time (h)

——A一 FS30D/GG without g^lactomannanse —■一- FS30D/GGwith galactomannanse —uncoated—©— FS30D

Fig. 1.20 Release profiles of 5-fluorouracil from uncoated, Eudragit FS30D coated and Eudragit FS30D and guar gum (GG) double coated pellets in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh; pH6.5, lOh) with (9.68>^10'3U/ml) and without

galactomannanase.

图1.20展现了在模拟胃肠道pH梯度介质中栽药小丸、Eudragit FS30D 包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣小丸的释药曲线。作为水溶性药 物,5-FU在0.lmol/L HC1中5min左右即完全从栽药丸芯中释放出来;Eudragit FS30D包衣小丸在4h的释药时滞后，受释药介质pH值的促发FS30D衣膜迅 速溶解，并在30min内释药97%左右。由此可见凭借Eudragit FS30D衣层可 以有效、迅速的实现pH促发药物释放。但是消化道的生理特点降低了这种 简单易行促发机制实际的有效性，即单纯使用Eudragit FS30D包衣会造成药 物在结肠前的提早释放，这可能会引起副作用的增加及治疗的失败。而借助 于内衣层瓜尔胶的保护，Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣小丸在进入 PH7.4PBS后药物并不会迅速释出，大约lh后药物开始释放，释药时滞共为

5h。时滞之后小丸进入模拟结肠的释放介廣中，无酶存在时瓜尔胶继续阻止 药物的释放，在此后10h的释药量达80%左右，而当有瓜尔胶水解酶存在时， 时滞后lh的释药量就达到65%左右，并在此后的4h释药完全，酶促释药效

果显著。

4.体内分析方法的评价

4.1方法的专属性

5-FU的HPLC图谱见图1.21。由图可知在建立的色谱条件下，5-FU和 内标的保留时间分别为6.4min和14.9min，内源性物质对药物和内标的测定

无干扰。

4,2标准曲线及线性范围

5-FU 血药浓度标准曲线方程为 R=0.0003238C-0.0001716 (1=0.9996), 血药浓度在20 ~ 800ng/ml范围内线性关系良好。

4.3方法精密度

Tabl.8 Precision of the determination of 5-fluorouracil in dog^ plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdeteeted (ng/ml )RSD(°/〇)

5051.01 土 1.823.57

Within-day200207.89士 8.514.09

600612.39±25.384.14

5050.87± 1.843.62

Between-day200206.76^9.124.41

600610.05土】9 石5322

4.4方法回收率

Tab 1.9 Accuracy of the determination of 5-fluorouracil in dog’s plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdeiected (ng/ml)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

5051.01±1.82102.02

200207.89 士 8.51104.95103.01 士 1.681.63

600612.39 土 25.38102.07

 

Tabl. 10 Extraction recovery of the determination of 5-fluorouracil in dog’s plasma (n^S).

c (ng/ml)Extraction recovery (%)Mean 土 SDRSD (%)

5071,38

20070.0972.03 ± 2.343.25

60074.63

4.6最低定量限

最低定量限为20ng/ml 4.7检测限

检测限为10ng/ml。

5.Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣的5-FU小丸犬体内的药物动力学研究

5.1血药浓度及药动学参数

犬口服5-FU载药小丸、Eudragit FS30D包衣小丸和Eudragit FS30D/瓜尔 股双层包衣小丸后的血药浓度数据分别见表1.11、表1.12和表1.13,平均血 药浓度-时间曲线图见图1.22，药动学参数见表1.14。

Tab. 1.11 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of uncoated

pellets (n=5)

TimeNo. of subjectsX土 SD

(h)12345

0000000

0,0833044.40028.2129.5220.43±19.70

0.25138.22160.6229.64152.23122.43160.63士41.21

0.5319.50366.6317.93318.96336.99331.88 土 20.64

0.7590.2385.8255.6885.02130.1889.39土 26.61

128.7323.85021.3666.7728.13 士 24.21

1.5000025.615.55 土 11.21

2000000

2.5000000

3000000

4000000

5000000

7000000

9000000

Tab. 1.12 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in beagle dog after oral administration ofFS30D coated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjects

12345

000000

100000

254,6400069.30

30102.63100.8494.700

400000

500000

600000

700000

800000

1000000

1200000

2400000

Tab. 1.13 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in beagle dog after oral administration ofFS30D/GG double coated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

000000

i00000

200000

300000

400000

500000

600041.270

749.44 0000

8065.6139.79071.75

1000000

1200000

2400000

Tabl. 14. Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of 5-fluorouracil iii beagle dogs (n=5) after oral administration of (dose 50 mg) of 5-FU formulations.

parametersUncoated pelletsFS30D coated pelletsFS30D/GG coated pellets

Cmax (ng/ml)332.00 土 20.8984.42±21.3453.57±14.44 *

T,nax (h)0.50±0.002.6 土 0.557.4±0.89 * *

vs uncoated pellets, at P<0.01; # vs FS30D coated pellets, at P<0.01

从表1.14可以看出3种小丸体内行为明显不同。FS30D包衣小丸和 FS30D/瓜尔肢双层包衣小丸的Tn^分别为2.6h和7.4h明显长于栽药丸芯 (0.5h ); Cmax分别为84.42ng/ml和53.57ng/ml也远低于载药丸芯 (332.00ng/ml )。由此可以看出两种包衣的小丸均可不同程度地延缓药物的释 放，其中FS30D/瓜尔胶双重包衣小丸的延缓效果更为显著。

由于FS30D包衣小丸和FS30D/瓜尔胶双层包衣小丸均只测得一个时间 点的血药浓度，因此在图1.22中仅对栽药丸芯做药-时曲线图，而对于FS30D 包衣小丸和FS30D/瓜尔胶包衣小丸分别以不同时间下实际检出的平均血药 浓度柱状图表示药物进入体循环的时间及浓度。虽然无法得到AUC和Tlag等 药动学参数，但从图1.22可以看出：与5min后药物即进入体循环的速释栽 药丸芯相比，FS30D包衣小丸可延缓药物释放，但释药时滞过短仅为2~3h 左右，意味着药物在到达结肠前便被释出，无法有效实现结肠靶向释药的目 的；而双重包衣小丸的口服吸收时滞在6~8h,与体外5h释药时滞接近，说 明双层包衣可以保护药物安全通过胃及小肠，到达结肠后才开始释放药物， 因此FS30D/瓜尔肢双层包衣小丸具有较好的结肠定位释药特性。

5.2讨论

EudragitFS30D包衣小丸的体外释药时滞■为4h，而犬口服EudragitFS30D 包衣小丸后最早于2 h在血中检出药物，表明小丸很快到达pH值>7环境， 衣膜溶解，药物释出。犬口服Eudragit FS30D/GG双重包衣小丸后最早于给 药后第6h在血中检出现药物，与体外5h的释药时滞接近。体外试验中，两

种包衣小丸的释药时滞仅差lh，体内试验:却有4h的区别，这可能与体内的 肠液量远小于体外试验有关，瓜尔胶吸水凝胶化速度变慢，因此同样厚度的 瓜尔胶衣层可在Eudragit FS30D衣膜溶解后更长时间保护药物不释放，直至 小丸转运至结肠酶降解瓜尔胶，药物释出。

用于评价结肠靶向释药系统的动物应在解剖学和生理学以及肠道微菌群 上与人密切相似。目前开发OCDDS的研究报道多选用大鼠、豚鼠和狗等动 物进行^，3(W4]。豚鼠因具有与人相似的结肠微菌群及相关酶系，被认为是最合 适作为生物可降解型OCDDS体内研究的动物模型，但因豚鼠胃排空较慢故 不常采用。本研究中曾经采用大鼠为模型动物，但由于一个剂量的小丸过多， 大鼠胃排空的速度极大减慢，因此最终选择了犬作为体内评价的试验动物。

证明药物结肠靶向的最直观可靠的方法是利用y-闪烁扫描法进行检测， 因大多数药物不含有适于Y-闪烁扫描研究的同位素，而需先标记药物或将放 射性物质（如99mTc、ulIn)加入制剂。放射性同位素有固定的半衰期，因此 要求制剂的制备工艺简单，制备周期短，并且应尽快进行体内试验。本研究 选用的是小丸剂，包衣过程相对复杂，并且与单一的固体制剂不同，小丸在 胃肠道中分散较广，判断小丸的位置较为困难，鉴于这些原因，本文没有进 行制剂的胃肠道转运行为的研究。

4.小结

结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，癌症死亡的第二大主因，目前 一线化疗药物仍为5-FU的注射剂。5-FU0CDDS的成功研制将可以降低或消 除药物在胃和小肠的吸收，提高病患局部的药物浓度，减少或避免药物进入 体循环引起的全身毒副反应，？文善5-FU对结肠癌的临床治疗效果。另外，水 溶性药物由于落解度大易导致药物过早释放一直是OCDDS研究中的难点， 5-FU为水溶性药物，基于瓜尔胶包衣的口服结肠定位释药系统，溶解度约为18mg/ml (溶解度与介质的pH无关），其 OCDDS的成功研制为其它药物OCDDS的设计提供了可行有效的新思路。

本章采取pH敏感-酶促发双重策略，分别用pH敏感材料Eudragit FS30D 和可生物降解的天然多糖瓜尔胶对栽药小丸进行双层包衣。体内、外试验结 果表明双层包衣小丸的释药时滞均在5-6h左右，表明双层包衣可保护药物安 全通过上消化道，到达结肠后开始释药。两种释药机制的共同控制使得5-FU 靶向于结肠释药更安全、有效^

本研究中选用了水溶液粘度最大的瓜尔胶作为可生物降解材料，采用瓜 尔肢醇/水混悬液喷雾包衣的工艺成功地将瓜尔胶包覆于栽药小丸，解决了亲 水性高分子材料难以用于小丸剂包衣的难题。

结肠靶向释药技术的关键在于保护药物到达结肠后释放，即给药系统需 克服胃和小肠平均5h的转运过程不释药。除了释药机制外，药物的溶解性 质也成为给药系统成功与否的关键。水溶性药物的溶解度大，易被溶解后扩 散进入介质，往往造成药物的提前释放[1_2]。难溶性药物的溶解度小，更易实 现5 h左右的释药时滞，但是较低的溶解度有时会引起药物进入结肠后释放 过慢甚至释放不完全[>4]。第一章以5-FU为水溶性模型药物，制备并评价 Eudragit FS30D/瓜尔胶双重包衣的结肠定位释药小丸，本章以难溶性药物吲 哚美辛为代表，采用相同的设计策略制备结肠定位释药小丸，考察体内外释 药行为，评价其结肠靶向性。通过比较5-FU和吲咮美辛2种结肠定位释药 小丸的处方组成及体内外释药行为，评价基于Eudragit FS30D/瓜尔胶双重包 衣的pH敏感-酶促发双重控制的结肠定位释药小丸的可行性。

Fluka Biochemika 内蒙古赤峰药业 Merck公司

江苏太仓制药厂 国际特品（香港）有限公司 上海化学试剂采购供应站 上海Colorcon包衣技术有限公司 法国NP Phami公司 法国Rhodia公司 degussa R6hm 公司

(Eudragit FS30D)

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg) 萘普生（内标）

乙睛（色谱纯）

1.材料

吲味美辛(批号020961)

聚乙烯吡咯烷酮（PVP^o)

聚乙二醇（PEG4000)

羟丙曱纤维素（HPMC, 5cPa-s) 蔗糖丸芯（PF101，710-850叫1) 瓜尔胶（guargum)

肠溶型丙烯酸树脂水分散体德国

1.材料与仪器

用于HPLC的试剂为色谱纯，盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、醋酸钠、 冰醋酸、梓橡酸等其他试剂均为分析纯

2.仪器

JGM-H50气流粉碎机华东理工大学

UV-2401PC型紫外分光光度计日本岛津

BS210S 电子天平Sartorius

Sartorius

BS610S电子天平

85-2型恒温磁力搅拌器

上海智威电器有限公司 自制

德国Glatt公司 浙江温岭市潘郎鼓风机厂 宁波石浦海天电子仪器厂 天津大学无线电厂 曰本Hitachi公司 德国安杰伦公司

微型流化包衣设备

GPCG1.1型流化包衣机

蓝森牌离心式单相交流鼓风机

DDB-320多功能电子蠕动泵

ZRS-8G智能溶出仪

S-520扫描电子显微镜

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪

(G1322ADEGASSER, G1311AQuatPump, G1313AALS, G1315B DAD) XW-80型旋涡混合器上海超声波仪器厂

3•动物

Beagle犬，3，8.0±2.0kg,普通级上海市新冈实验动物场

2.实验方法

1.体外分析方法的建立

1.1IDM小丸的含量测定HPLC方法的建立 1.1，1色谱条件

色谱柱：VenusilXBPM-C18(4.6mmxl50mm，5(im)

流动相：乙腈：0.1M醋酸納缓冲液（pH5.0) = 40:60 流速：1.0mL/min 柱溫：40°C 检测波长：320nm 进样量：20ul

1.1.2标准曲线的建立

精密称取IDM 50mg，加8ml曱醇超声溶解后用pH7.4 PBS定容于250ml 量瓶，作为鮮备液。分别吸取一定体积的贮备液，作不同倍数的稀释，所得 浓度（C)分别为 0.1、0.5、1、5、10、20、的标准溶液，HPLC 法 测定，以药物峰面积（A)对浓度（C，pg/ml)作线性回归，得标准曲线方

程。

U.3回收率试验

精密称取IDM 20、25、30 mg及处方量辅料各三份，置250 mL量瓶中， 加适量甲醇超声溶解后用pH7,4 PBS定容至刻度，离心，滤过，取续滤液10 倍稀释后，HPLC法测定，按标准曲线方程计算药物的含量，与加入量比较， 计算回收率。

1.1.4精密度试验

分别吸取一定体积的贮备液，作不同倍数的稀释，所得浓度（C)分别为 0.5、5、20吗/ml的标准溶液，在同一天内连续进样5次及连续5天测定，分 别计算日内差、日间差。

1.1.5溶液的稳定性

浓度为0.5、5、2〇ng/ml的标准溶液，室温下放置不同时刻后进样，测 定冷面积，考察该溶液的稳定性。

1.1.6小丸含量测定

精密称取相当于含IDM 25mg的小丸，在研钵中加适量的pH7.4 PBS后 充分研磨至完全溶解，转移至100 ml量瓶中，加入适量曱醇超声后用pH7.4 PBS定容。离心(3500rpm，15min)、过滤，续滤液稀释后，HPLC法测定，

按标准曲线方程计算药物的含量。

1.2吲咮美辛小丸体外释放度测定HPLC方法的建立

1.2.1色谱条件（见本章实验方法1.1 )

1.2.2标准曲线的建立

精密称取 IDM 50 mg,别用 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 定容，

吸取一定体积的溶液，作不同倍数的稀释，HPLC法测定，以药物峰面积（A) 对浓度（C, pg/ml)作线性回归，得标准曲线方程。

1.2.3释药介质中的稳定性（37°C)

释药标准曲线上高、中、低三个浓度的标准液，分别于不同时刻进样测 定峰面积，考察释药过程药物的稳定性。

1.2.4释药回收率试验

精密称取IDM 50 mg置于100 ml量瓶中，再称取相当于一个剂量的辅料 加入到上述量瓶中，分别加入0.1MHC1、pH6.8、pH7.4和pH6.5PBS,超声

后定容。分别吸取一定体积的溶液，作不同倍数的稀释，HPLC法测定，以 测得的量和加入的量比较，计算回收率。 1.2.5精密度试验

释药标准曲线上高、中、低三个浓度的标准液，在同一天内连续进样5 次及连续5天测定，分别计算日内差、日间差。

1.2.6检测限

用已知浓度的样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，按信嗓 比S/N=3时相应浓度确定检测限。

2.载药小丸的制备

2.1药物的微粉化

采用水混悬液喷雾上药，为了均勾上药及防止混悬液中的固体颗粒堵塞 喷嘴，上药前IDM经气流粉碎机微粉化，粒径<10叫1。

2.2载药丸芯的制备

用微型流化床预试空白丸芯混悬上药的处方和工艺后，用GPCG1.1型 Glatt流化床制备栽药丸芯。将粘合剂PVP溶于水中（6%, W/V),搅拌下将 微粉化的药物分散于其中制成混悬液，即可用于喷液上药。上药过程中需要 连续搅拌药物混悬液。载药丸芯的制备工艺如下：

微型流化床：空白丸芯10g，喷嘴直径0.5mm,控制出口温度41-44°C， 喷液速率l.Oml/min，在固定的风量和雾化压力下进行喷液上药。

Glatt流化床：空白丸芯lOOOg,底喷法，喷嘴直径1mm,进风温度65°C， 物料温度51°C，流化风量110-116m3/h，喷雾•压力1.5bar，喷液速率10-12g/min。 载药结束后，继续流化干燥5min，接着包一层HPMC隔离衣，增重约为2 % (W/W),防止小丸在贮存过程中粘结。最终制得小丸约1424g。用筛析法 通过称重测定小九的粒径分布，筛取18-24目的小丸用于包衣。

3.EudragitFS30D/瓜尔胶双重包衣小丸的制备、释药影响因素及体夕卜评价

依次用粘度为5200 ~ 5500cps的瓜尔胶和Eudragit FS30D对H)M载药丸 芯进行包衣。与第一章相同，双层衣保护药物通过胃和小肠至结肠后，酶促 发瓜尔胶水解，药物释出。由于IDM为难溶性药物，期望较薄的瓜尔胶衣层 即达到同样的保护作用„

3.1瓜尔胶包衣小丸的制备及释药影响因素

3.U包衣液的配制（同本文第一章实验方法中的3.U)

3.1.2小丸包衣（同本文第一章实验方法中的3.1.2)

3.1.3释放度试验

按中国药典2005版规定的转篮法测定。称取适量包衣小丸（含IDM 25mg)，装于转篮中，置于900ml恒温37±0.5°C的的释放介质中，转速为75 rpm，定时取样5ml,同时补充等量同温的新鲜介廣。样品经0.45阿微孔滤 膜过滤后，续滤液经HPLC法测定，通过标准曲线计算药物的累计释放百分

率（Q )。

分别以 0.1mol/L HC1、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作为模拟胃、 小肠中前段（十二直肠和空肠）、小肠后段（回肠）及结肠pH环境的释放介 质。含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS模拟在体结肠的酶环

境。

3.1.4释药影响因素

第一章中以5-FU为模型药考察了瓜尔胶粘度对瓜尔胶包衣小丸释药行 为的影响，粘度在5200~ 5500cps时瓜尔胶衣层对药物的阻滞能力最强，因 此在本章中重点考察包衣增重及释放介质对瓜尔胶包衣小丸释药行为的影

响。

3.1.4.1瓜尔胶包衣增重的影响

考察不同包衣增重下小丸的释放度。

3.1.4.2释药介质pH的影响

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 四种释放介质对

瓜尔肢包衣小丸释放度的影响。

3.1.4.3瓜尔胶水解酶的影响

考察瓜尔胶包衣小丸在含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS

中的释药行为。 3.2EudragitFS30D包衣小丸的制备

本文第一章已经以5-FU为模型药物对FS30D包衣小丸进行的筛选和评 价，在本章中依照第一章确定的包衣工艺对IDM载药丸芯进行包衣及热处 理，包衣增重至30%，并验证包衣小丸在pH梯度的释放介质中（0.1mol/L HC1,

2h、pH6.8PBS，2h和 pH7.4PBS, lh)的释药行为。

3.3Eudragit FS30D/瓜尔胶双重包衣小丸的制备及体外释药评价 3.3.1小丸的包衣

依次按本章实验方法中3.1.2和3.2项下的操作对载药丸芯进行瓜尔胶内 层包衣及Eudragit FS30D外层包衣，包衣增重分别为44%和SO%.

3.3.2释放度试验

转篮法测定。余下操作同3.1.3项下所述。分别以0.1mol/LHCl(2h)、 pH6.8 PBS(2 h)、pH7.4 PBS(1 h)和 pH6.5 PBS(12 h)作为释放介质，模拟胃、 小肠中前段（十二直肠和空肠）、小肠后段（回肠）及结肠的pH环境。pH6.5 PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.0097U/ml)模拟在体结肠的酶环境。

4.扫描电镜观察

用扫描电镜观察FS30D/GG双层包衣小丸的剖面结构。

5.体内分析方法的建立

IDM是临床上常用的消炎镇痛药物，测定IDM血药浓度的方法主要为 高效液相色谱法(HPLC)。本文参考文献报道的分析方法[51，采用下述的反相 高效液相色谱法测定犬口服IDM制剂后的血药浓度。

5.1色谱条件

色谱柱：VenusilXBPM-C18(4_6mmxl50mm，5(xm)

流动相：乙腈：0.1M醋酸钠缓冲液（pH5.0) = 40:60 流* 速：1 .OmL/min 柱溫：40°C 检测波长：320nm 内标：萘普生(10(ig/ml)

进样量：20ul

记录IDM与萘普生的峰面积比为响应参数，内标法定量。

5.2血浆样品处理方法

精密吸取犬血浆500^1,萘普生(10pg/ml)10〇nl, 2%杵橡酸500叫于15ml 离心管，加入5ml乙謎，旋涡混合5 min,离心15min (3500rpm),取上层有机 层于5ml洁净离心管中，于40°C水浴中用氮气吹干，残渣用lOOfil流动相溶

解，离心后取20pl进样分析。 5.3血药浓度标准曲线的建立

精密吸取犬血浆50(Hil，加入IDM标准溶液（100^1),使浓度分别为50、 100、250、500、1000、2500、6000ng/ml,加入内标的方法同上，按血样品 处理方法操作，以HPLC法测定，基于瓜尔胶包衣的口服结肠定位释药系统，以样品峰面积与内标峰面积的比值R( A1DM/A 茶普生）对样品浓度（C_)作线性回归，求回归方程。

5.4血药浓度分析方法的评价

5.4.1方法精密度

取空白血浆5004数份，加入IDM标准溶液，使浓度分别为50、500、 2500ng/ml,加入100^1内标溶液，按血浆处理方法操作并作色谱分析。一天 内重复五次，统计测定数据的相对标准偏差RSD,即为方法的天内精密度。 连续五天重复操作，统计测得数据的RSD，即为方法的天间精密度。

5.4.2方法回收率

取空白血浆500^1数份，加入5-FU标准溶液，使浓度分别为50、500、 2500ng/ml，加入100^1内标溶液，每一浓度配置五份样品，按血浆处理方法 操作并作色谱分析，以测得的浓度对实际浓度之比计算方法回收率。

5.4.3提取回收率

取空白血浆500^1数份，加入5-FU标准溶液，使浓度分别为50、500、 2500ng/ml,每一浓度配置五份样品，按血浆处理方法操作并作色谱分析，分 别与同浓度的5-FU标准溶液直接进样的峰面积做比较，计算方法回收率。

5.4.4检须扦艮

用已知浓度的样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，按信噪 比S/N=3时相应浓度确定检测限。

5.4.5最低定量限

样品中被测物能够被定量测定的最低量，其测定结果应满足一定的准确 度和精密度（兄狀20 % ,这20 % ,测定偏差E = (C *rC标)/C标xi〇〇 % )。

6.Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣的IDM小丸在犬体内的药物动力学研究

6.1研究对象

Beagle犬5只，丄8.0±2.0kg,普通级

6.2试验制剂与参比制剂

受试制剂：FS30D/GG双重包衣小丸：FS30D层包衣增重30%, GG层包衣 增重44%。

参比制剂：载药小丸

FS30D包衣小丸，包衣增重30%。

6.3试验设计 服药方法：

采用自身对照交叉试验设计，洗净期为1周。5只犬，禁食过夜（18h), 次曰清晨空腹给药(含IDM 25mg)，用10ml水灌胃。由于本章Eudragit FS30D/ 瓜尔肢双重包衣小丸和后文第四章中瓜尔肢-乙基纤维素包衣小丸的犬体内 药物动力学研究均以IDM载药小丸为参比制剂，因此两部分药物动力学试验 一起冗成。服药方案见表2.1。

Tab2.1 Design of administration method of subjects receiving four formulations.

SubjectPhase of administration

iiimIV

IABCD

2BCDA

3CDAB

4DABC

5ACBD

Aruncoated pelletsB: FS30D coated pellets

C: FS30D/GG doubble coated pellets D: GG-EC mixed coated pellets

羊采集：

于服药前后设定的时间从前肢静脉取血1.2ml,置于肝素钠离心管中， 8000rpm离心lOmin，取上清血桨于-20°C冷冻保存，待分析。

服用载药小丸的取样时间点：20min、40min、60min、1.5h、2h、3h、4h、 6h、 8h、 10h、 12h。

服用FS30D包衣小丸的取样时间点：lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、 10h、 12h、 24h、 30h。

服用FS30D/GG双重包衣小丸的取样时间点：lh、2h、3h、4h、5h、6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h、 30h。

样品分析方法:

用本文建立的HPLC法测定血浆中的IDM浓度.

6.4数据处理

用梯形法计算AUC,实测法读取*Tmax，用3p87软件计算(Lagtime， Tlag)及平均滞留时间（MRT)，用t检验法对药动学参数进行方差分析(方差 分析时AUC和C_经过对数转换）。

3.结果与讨论

1.体外分析方法的评价

1.1IDM含量测定分析方法的评价 1.1.1含量测定标准曲线

在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，IDM在0.1 ~ 40pg/ml的范围内，药物峰面 积和浓度的线性良好，标准曲线方程为：A=26.6667C+0.5680 (尸0.9994)

1.1.2回收率试验 结果见表2.2

Tab2.2 Accuracy of indomethacin in pH7.4 PBS.

Cadded (Hg’ml) Cdetected (终&^1)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD(%)

87.86. 士 0.1198.25

1010.13±0.14101.30100.52± 1.991.98

1212.24 士 0.18102.00

1.1.3精密度试验

Tab2.3 Precision of the determination of indomethacin in pellets. (n=5).

AddedDetctedRSD

(n_)(Hg/ml)(%)

0.50.49±0.036.12

Within-day55.05 士 0.09L78

2020.78士 0.231.11

0.50.50 土 0.024.00

Between-day54,94 士 0.122.43

2019.86i〇.432.17

1.1.4 IDM稳定性试验

浓度为0.5、5、2〇ng/ml的IDM标准溶液，室温下放置0 h、6 h、12 h 后HPLC法测定，考察该溶液的稳定性。

Tab2.4 Stabality of indomethacin in pH7.4PBS through 24h (n=3).

AddedDetcted (^g/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h12 hMean iSD

0.50.520.490.470.49 士 0.036.12

55.044.924.904.95 土 0.081.61

2019.9819.8519.7619.86 士 0.110.56

表明IDM在pH7.4PBS中12h内稳定。

1.2IDM小丸体外释放度测定方法的评价 1.2.1释药标准曲线

四种释放介质中，IDM吸收度和浓度的线性曲线方程分别为： 0.1MHC1A=26.0417C+2.2813 (r=0.9998)浓度范围：0.1 ~ 8pg/ml

0.1 ~ 40j^g/ml 0.1 ~40^g/ml 0.1 〜40 卩 g/ml

pH6.8PBSA=27.5482C+2.1322 (r=0.9997)浓度范围

pH6.5PBSA=27.0270C+0.4216(r=0.9996)浓度范围

pH7.4PBSA=26.6667C+0.5680(r=0.9994)浓度范围

1.2.2IDM在释药介质中的稳定性考察

37。(：水浴下不同时间IDM在四种释放介质中的浓度见表2.5。

Tab2.5 Concentration of indomethacin in different dissolution media at different time (n=3).

O.lMHCi

AddedDetcted(M_)RSD

(Hg/ml)Oh2h4hMean ±SD

0.50.520.490.460.49 土 0.036.12

22.001.861.821 廉 0.094.76

88.017.857.517.79 士 0.263.34

pH6.8PBS

AddedDetcted(Hg/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h20 hMean 土 SD

0.50.520.500.470.50 士 0.036.00

55.015.014.95499 士 0.030,60

2020.0419.9519.8619.95±0.090.45

 

AddedDetcted (|ig/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h20 hMean ±SD

0.50.510.490.460.49 土 0.036.12

55.025.025.075.04 士 0.030.60

2019.7619.6719.7219.72 士 0.050.25

pH7.4PBS

AddedDetcted (ng/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h .20 hMean ±SD

0.50.510.500.470.49 土 0.024.08

55.055.035.005.03士0.030.60

2019.8719.8519.7619.82 士 0.060.30

表明IDM在体外释放度试验过程中稳定性良好，分析方法有效可行。

1.2.3释药回收率及精密度试验

IDM释药回收率见表2.6。测定方法的日内和日间精密度见表2.7。结果

表明，所建立的分析方法准确、可靠。

Tab2.6 Accuracy of indoraethacin in defferent dissolution media.

Cadded Hg/ml)C detectedAccuracy (%)Mean 土 SD RSD(%)

0.50.49 士 0.0398.00

0.1MHC122.05 士 0,08102.50100.42± 2.272.25

88.06±0.16100.75

PH6.8PBS0.50.48±0.0496

55.11 土0.13102.298.88^3.123.16

2019.69 士 0.7898.45

PH6.5PBS0.50.52±0.03104.00

55.08 土 027 ’101.60102.22士 1.571.53

2020.21±1.16101.05

0.50.51±0.04102.00

PH7.4PBS54.98 土 0.1799.60100.17 土 1.631.63

2019.78 土 0.3698.90

AddedWithin-dayBetween-day

(Hg/ml)Detcted (ng/ml)RSD (%)Detcted (卩 g/ml)RSD(°/〇)

0.50.49±0.024.680.49 土 0.036.12

0.1MHCI22.08 士 0.02U61.96土 0.031.53

88_06土0.132.017.86 土 0.091.15

0.50.49±0.012.370.50 士 0.036.00

PH6.8PBS55.08 士 0.122,395.04±0.163.17

2020,59 士 0.492.3920.27土 0.673.31

0.50.50 土 0.024.000.50±0,024.00

pH6.5PBS54.98 士 0.204.064.96 土 0.112.22

2020.20土0.753.7320.19土 0.733.62

0.50.49 士 0.012.250 廉 0.024.00

pH7.4PBS54.91 士 0.163.164.97±0.142.82

2020.07士 0.552.7219.86 土 0.432.17

1.2.4检测限

检测限为25ng/ml。

1.3讨论

相同浓度下IDM的紫外吸收灵敏度远低于5-RJ。一个剂量的IDM小丸 (25mg )在900ml释放介质中释放10% (药物浓度为2.7pg/ml)时的紫外吸 收值仅为0.04左右（X=320nm)。本文的重点是考察制剂的延迟释药时滞，采 用紫外分光光度法测定药物的累计释放量会给试验结果带来较大误差，因此 采用更为准确的HPLC法作为体外分析方法.

2.载药小丸的评价

本文采用IDM水混悬液法在Glatt流化床中对粒径分布为710-85〇nm的 空白丸芯喷雾上药，上药效率达93.42%,粒径范围在18~24目的载药小丸 占98.35°/。（图2.1),小丸的栽药量为27.27%。本文第二章与第四章的研究 均采用同一批载药丸芯。

测定载药小丸在不同介质中的溶出度，结果见图2.2。由于化学结构中羧 酸基团的存在，IDM在不同介质中的溶解度不同，随着介质pH值的增高， 溶解度增大。因此载药小丸在各介质中的溶出速度随溶解度的增大而增大。 

IDM在pH7.4 PBS中，1 h完全溶出（pH7.4 PBS中IDM的溶解度约为 1.58mg/ml);在 pH6.5 PBS 和 pH6.8 PBS 中的溶出度近似(pH6.5 PBS 和 pH6.8 PBS中IDM的溶解度接近，约为0.54 mg/ml), 6 h药物的溶出总量接近100%; 而在O.lmol/LHCl中6h药物的溶出量不超过5%,此时载药丸芯已经完全破 碎，药物粉末沉积在溶出杯底，这是由于在O.lmol/LHCl中药物的溶解度极 小，小于 10fig/ml。

3.EudragitFS30D/瓜尔胶双重包衣小丸的评价

3.1瓜尔胶包衣小丸的评价

3.1.1包衣增重及释药介质pH对小丸释放度的影响

由于IDM在介质中的释药行为与其溶解度有关，且在O.lmol/LHCl中药

物的溶解度极小，pH6.5 PBS和pH6.8 PBS中的溶解度近似。因此仅采用pH6.5 PBS和pH7.4 PBS 2种释放介质考察包衣增重对瓜尔肢包衣IDM小九释药行

为的影响。

从图2.3和图2.4可以看出两种释放介质中瓜尔肢衣层均可在不同程度上 延缓药物的释放。包衣增重相同时IDM小丸在pH7.4 PBS中的释放快于在 pH6.5 PBS中的释放。表2.8分别歹|J出在2种释放介质中不同包衣增重小丸的 T10及T5G (药物释放10%和50%所需的时间）。随着包衣层厚度的增加，T10 和T5G增大，在释放较快的pH7.4PBS中，包衣增重为44%时即可实现T1()在 lh左右，这与第一章中以5-FU为模型药，包衣增重达580%时的效果一致。 在各种瓜尔胶包衣增重下，与5-FU小丸相比，IDM小丸除了具有明显长的 释药时滞外，药物的释放速度也更慢。以包衣增重为580°/。的5-FU小丸和包 衣增重为499%的IDM小丸为例，5-FU小丸在不含酶的释放介质中2.5 h就 有50%的药物释出，而IDM小丸即使在释放较快的pH7.4 PBS中，12h的释 放总量也仅为45%左右。总之，瓜尔肢对难容性药物的阻滞能力明显强于对 水溶性药物的阻滞。

024681012

Time (h)

—0% --e— 44% —93% —6— 184% -A— 311% -B— 499%

Fig.2.4 Release profiles of indomethacin from guar gum coated pellets in different coat weight gain in

pH7.4 phosphate buffer.

Tab2.8 Ti〇 and Ts〇 of guar gum coated pellets in different coat weight gain in pH6.5 and pH7.4

phosphate buffer.

Coat weight gain

44%93% 184%311%499%

T,〇(h)3.54.04.04.05.5

pH6.5

T5〇(h)8.513.816.319.0>20.0

T,〇(h)1.11.41.72.02.8

pH7.4 PBS

T5〇(h)4.04.76.09.8>12.0

Ti〇and Ts〇 were calculated by interpolating data of each individual release profile.

3.1.2瓜尔胶水解酶的影响

酶促型OCDDS的原理及优势在于结肠内微菌群可特异性地降解相关材 料，而保证释药系统成功定位于结肠释放仅是OCDDS的任务之一，随后药 物的释放速度和程度则直接关系到病灶局部的药物浓度是否维持在有效浓度 之上，将最终影响治疗效果。因此分别考察了 5种增重的瓜尔肢包衣小丸在 含有半乳甘露糖苷酶释放介质中的释药行为（图2.5)，筛选适宜的瓜尔胶内 衣层厚度。由图2.5可以看出，5种包衣增重的小丸在酶存在时10 h的累积 释放量分别为100%、100%、78%、45%和36°/。，包衣层越厚，小丸的释药 速度越慢。Krishnaiah等[~研制的不同包衣增重的IDM瓜尔胶压制包衣片在 4%的肠内容物中10h的累积释放量最大也仅有10%。采用压制包衣技术制备 的可生物降解型OCDDS,包衣过程使用较大压力，形成非常紧密的包衣层， 虽然可保护药物安全通过胃和小肠，但是衣层的吸水溶胀速度过慢导致压制

包衣片进入结肠后酶不易进入包衣层发挥降解作用。如果药物的溶解度又较 低，释药速度就更加缓慢。本文所采用的流化包衣技术没有引入外力，仅通 过瓜尔胶自身的粘性将瓜尔胶堆积于小丸表面，结构较疏松，在水性环境中， 瓜尔胶衣层易被水化，因而小丸在进入结肠后可以较快地发生酶降解作用。

(b)

⑷

鉴于瓜尔胶包衣增重为44%时，IDM小九在pH6.5 PBS和pH7.4PBS中 的T1()分别为3.5h和l.lh,可保护药物在外衣层Eudragit FS30D溶解后不致 迅速释出，将更多的IDM运送至结肠发挥治疗作用。较小的包衣增重使得小 丸进入结肠后瓜尔肢衣层可被酶迅速降解，药物以较快速度释出，因此选择 瓜尔胶内衣层增重44%,

—184%-withgalactomannanase^ ......_

311%-with galactomannanase

—184%-without galactomannanase311%-withoiit galactomannanase

(C)

(d) 

 

20

(e)

Fig2.5 Release profiles of guar gum coated pellets of indomethacin with different coat weight gain: (a) 44%, (b) 93%, (c) 184%, (d) 311%, (e) 499% in the absence and presence of galactomannanase in

pH6.5 phosphate buffer.

3.2Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣小丸的性状及体外释药评价

分别对载药丸芯进行瓜尔胶和Eudragit FS30D双重包衣，基于瓜尔胶包衣的口服结肠定位释药系统，包衣增重分别 为44%和30%。图2.6为FS30D/瓜尔股双重包衣小丸在电镜下的剖面图。从 图中可以看到瓜尔胶衣层疏松、粗糙，而载药层致密、均匀。这是由于上药 前IDM经微粉化后粒径小于10pm,而瓜尔肢的粒後在300目左右„与第一 章中5-FU双层包衣小丸相比，IDM小丸的内衣层瓜尔股增重很小，电镜下 观察到IDM小丸内、外衣层的厚度接近，整个小丸的粒径很小仅为1.1 mm 左右„

图2.7展现了在模拟胃肠道pH环境的梯度释放介质中载药小丸、Eudragit FS30D包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜尔股双重包衣小丸的释药曲线。作为难 溶性酸性药物,IDM的溶解度与介质的pH值有关。IDM在0.1 mol/L HC1中 的溶解度小于1 〇Hg/ml，因此在pH梯度释放介质中载药丸芯最初2 h (0.1 mol/L HC1)的释放总量小于4%,但在随后2 h的pH 6.8 PBS中的释药量达 92.67%。对于Eudragit FS30D包衣小丸而言，FS30D衣膜保护药物前4 h不 释放，进入pH7.4 PBS后衣膜迅速溶解，并在30 min内释药76%左右，1 h 释药接近完全。而加入增重44%的瓜尔胶内衣层后，双层包衣小丸在进入 PH7.4PBS后并不会迅速释药，在经过约为0.5 h的时滞后药物开始缓慢释放， 此时总的释药时滞为4.5 h;当双层包衣小丸进入模拟结肠的释放介质时（即 第5 h)，小丸的释药总量仅为5.5%，实现了保护药物至结肠的目的。此后 在瓜尔胶水解酶的作用下，瓜尔胶降解，药物迅速释出，lh的释药量达55% 

enteric coat (EudragitFS30D)

(guar gum)

and guar gum at a magnification of 150 folds.

左右；如无酶存在，瓜尔股继续阻止药物释放，15 h后释药完全。因此对于 难溶性药物而言，少的瓜尔胶衣层增重（44%)既可以有效延缓药物释放， 也可以迅速经酶促发释药。

4.体内分析方法的评价 4.1方法的专属性

IDM的HPLC图谱见图2.8。由图可知在建立的色谱条件下，IDM和萘 普生的保留时间分别为6.8min和4.7min，内源性物质对药物和内标的测定无

干扰。 

pellets.

4.2标准曲线及线性范围

IDM血药浓度标准曲线方程为R=0.001382C-0.002352 (r=0.9999)，浓 度在50 ~ 6000ng/ml范围内线性关系良好。

4.3血药浓度分析方法的评价 4.3.1方法精密度

Tab2.9 Precision of the determination of indomethacin in dog's plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdetected (ng/nil)RSD (%)

5049.38土 0.941.90

Within-day500510.19 土 6.541.28

25002543.67±30,811.21

5049.52±2.154.34

Between-day500519.58 土 7.942.12

25002532.63±14.380.56

4.3.2方法回收率

Tab2.10 Accuracy of the determination of indomethacin in dog^s plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)C detected (ng/ml)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

504938±〇.9498.76

500510.19土 6.54102.04100.84土 1.811.79

25002543.67±30.81101.72

 

4.3.3提取回收率

Tab2.11 Extraction recovery of the determination of indomethacin in dog9s plasma (n=5).

C (ng/ml)Extraction recovery (%)Mean ± SDRSD (%)

5085.36

50082.0985.01 ±2.763.24

250087.57

1.3.4检测限

检测限为25ng/ml。

1.3.5定量限

最低定量限为50ng/ml。

5,Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣的IDM小丸犬体内药物动力学研究

5.1血药浓度及药动学参数

犬口服IDM栽药小丸、Eudragit FS30D包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜尔 胶双重包衣小丸后不同时间的血药浓度数据见表2.12、表2.13及表2.14,平 均血药浓度-时间曲线见图2.9,药动学参数见表2.15。

Table2.12 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration ofuncoated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjectsX士 SD

12345

0000000

0.3331034.67241.89594.51747.61478.85619.51 士296.55

0.6672867.05587.70754.781896.711619.791545.21土924.39

15295.521619.791175.222863.024477.163086.14士1779.60

1.54135.643227.254500.864144.972783.643758.55土720.62

21663.004264.372855.211799.781741,852464.86士 1117.86

3880.421807.341540.22970.031001.841239.97土409.55

4323.81863.55645.88345.44422.10520.16±230.44

6180.47430.04358.70141.06195.41261.14土 125.79

8134.69164.35136.11111.14123.26133.91 士 19.77

10112.18119.11123.2858.9860.5794.83±32.25

1252.19049.760020.39±27.79

Table2.13 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration of Eudragit FS30D coated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjectsX士SD

12345

0000000

10048.49009.70士 21.67

23698.833676.26709.622975.29668.532345.59士 1540.28

31076.741451.713088.401050.792946.461922.34士 1013.51

4317.43664.72484.29484.63930.38576.98土232.63

5387.96357.88201.70200.32494.49328.64士 126.93

6300.25304.69139.45219.32448.93282.45士 114.32

7259.27333.19349.82248.39349.39308.77土 50.05

8168.21586.78102.40154.16281.27258.41±194.52

10408.00554.18713.42529.00512.94542.92土 110.04

12637.54498.29560.03560.37410.50533.28士 84.56

24104.17165.72251.42261.57204.31197.36土 64.67

30097.2452.9742.1652.6449.16±34.64

Table2.14 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration of Eudragit FS30D/GG double coated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

0000000

1000000

2000000

358.98247.3450.41276.29240.42174.69±110.41

4131.90533.2798.881454.21650,34573.72土 548.51

5404.781073.171421.831381.331515.591159.34土453.28

6688.601163.92929.19889.961001.84934.70士 172.95

7694.40825.82702.89562.09422.10641.46士 154.10

8445.07492.79318.05286.94303.38369.25土 93.20

10431.61390.89440.20495.02213.72394.29土 107.54

12372.18379.58414.54466.78245.02375.62士 82.02

24268.1880.26228.6850.0682.95142.03土 98,98

30053.8061.84056.3234.39士 31.53

Tab2.15. Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of indomethacin in beagle dogs (n=5) after oral administration of (dose 25mg) of IDM formulations.

ParametersUncoated pelletsFS30D coated pelletsFS30D/GG coated pellets

AUC〇.〇〇(ng/mIh)8779.40土 1133.9413074.11土709.308852.81 士990.12 #

C,™x (ng/ml)4665.27±541.383296.87土390.721295.51±354.50*#

T陳(h)1.48 士 0.392A6±0A95.41±0.77*#

T.ag(h)0.26±0.070.99 士 0二02.84 土 0.41

MRT(h)2.56 土 0.6710.60 土 2.0111.68±1.67*

* vs uncoated pellets, at P<0.01; # vs FS30D coated pellets, at P<0.01

-uncoated pellet s -FS30D coated pellets -FS30D/GG pellets

EudragitFS30D包衣小丸在体外释放度试验中第4h开始释药，而犬口服 后最早在第lh即在血中检测到药物，Tlag仅为0,99h，这与第一章中5-FU的 Eudragit FS30D包衣小丸的体内行为一致，最早于给药后的2 h从血中检出 5-FU。表明小丸口服后l-2h即被转运到pH值>7的肠段。Eudragit FS30D/ 瓜尔胶双层包衣小丸于给药后3h在血中检出药物，Tlag为2.84h，短于体外试 验中4.5h的释药时滞。双层包衣小丸口服后很快即被转运到pH值>7的肠液 中，Eudragit FS30D衣膜溶解，瓜尔胶暴露于肠液中，由于瓜尔胶层的增重 仅为44%,并且小丸在FS30D溶解后和进入结肠前一直处于pH值较高的环 境，这可能是引起体内释药时滞缩短的主要原因。当然也有可能因为犬胃肠 道的生理学特点与人不尽相同，固体制剂在其中的转运时间与人体有异。

表2.16以F值CP=AUC〇_t/AUCVooX 1 〇〇%)间接揭示了 3种小丸在犬体内 不同时间的释药程度。对于载药丸芯，3h的芦值即达72.39% ; Eudragit FS30D 包衣小丸的F值在3h为25.37%, 5h达38.89%;而Eudragit FS30D/瓜尔肢双 层包衣小丸的F值在4h仅为5.39%, 5h为15.81%。这表明口服3种小丸后 载药丸芯可迅速释出药物；Eudragit FS30D衣层虽可在一定程度上延迟药物

的释放，但到达结肠前药物的释出过多（约40%左右）无法实现有效的结肠 定位释药；而Eudragit FS30D/瓜尔胶双衣层可有效避免药物在上消化道的释 放，将更多的药物（约85% )浓集于结肠释出，可发挥更好的治疗作用。

对于AUC而言，Eudragit FS30D包衣小丸最大，Eudragit FS30D/瓜尔 胶双层包衣小丸与载药丸芯无显著性差异（p>0.01)。这与吲味美辛为脂溶性 药物，在整个肠段均有较好的吸收有关。

Tab2.16. The fraction of AUC〇.t under different time against AUC〇-〇〇.

FormulationTime interval

0〜3h0〜4h0〜5h

Uncoated pelletsAUC〇.t(ng/ml-h)

AUCo^ng/mlh)6355.417235.47

8779.408016.76

F72.39%82.41 %91.31 %

FS30D coated pelletsAUC〇.t(ng/ml-h)

AUC〇-〇〇(iig/ml.h)3316.794566.24

13074.115018.65

F25.37 %34.93 %38.89%

FS30D/GG coated pelletsAUC〇.t(ng/ml*h)

AUC〇-〇〇(ng/ml_h)103.04477.24

8852.811343.77

F1.16%5.39 %15.81%

F= (AUC〇V AUC〇^) xl〇〇%

5.2讨论

体内验证药物的结肠靶向性一直是口服结肠定位释药系统研究的关键和 难点。本文选用犬做为动物模型，发现以Eudrgit FS30D为包衣材料的pH敏 感型OCDDS，不论是以5-FU还是以IDM为模型药，在体内的释药时滞均 小于体外。这可能与以下两种原因有关：1、小丸在犬胃和小肠的转运时间小 于5h。2、犬小肠中部的pH值即在7以上。第一种可能性已被其他研究者所 验证。以对乙酰氨基酚为模型药的CODES™在犬体内的药动学表明药物延 迟吸收时滞为3h，而体外释药时滞为5h，而对照制剂（普通肠溶衣）0.5h即 入血吸收，表明犬的胃排空时间不到半小时[6-7]。分别以甘草皂甙和柳氮靖此 啶为模型药的结肠靶向制剂PCDCS犬体内的药动学试验表明药物的延迟吸收 时间分别为3.3h和3.5h小于体外5h的释药时滞[8-9]。另外1993年Davis等人 的研究表明犬小肠转运时间仅有2h左右[1Q]。

本章制备的吲咮美辛Eudrgit FS30D/瓜尔胶双层包衣小丸的粒径仅在 1.1mm左右，因此以后的工作中可以选用大鼠为动物模型，考察不同动物的 转运时间对体内释药时滞的影响，并可以进行不同时间药物在胃肠道分布的 试验，更加直观地了解药物在体内的动态变化。

另外为了延长体内的释药时滞，可以适当增加内衣层瓜尔胶的厚度，降 低达到结肠前药物的前释，更好的实现药物的结肠靶向转运。

4.小结

本章以吲哚美辛为模型药进行了 pH-酶双重促发的结肠定位释药小丸的 研究，体外释放度试验表明瓜尔胶内衣层的厚度在44%即可形成有效时滞， 与5-FU同种小丸相比，瓜尔肢层的厚度降低了 92%左右。体内试验表明， 与栽药小丸相比，EudrgitFS30D/瓜尔胶双重包衣的吲哚美辛小丸可以显著延 长药物的Tmax、Tlag和MRT，并降低Cmax，实现了结肠靶向释药的目的。

结合第一章的试验结果可知Eudrgit FS30D/瓜尔胶双重包衣可以通过 pH-酶双重释药机制保护难容性药物IDM和水溶性药物5-FU通过上消化道， 将大多数药物运送至结肠后释放。两种溶解性能的药物实现同样的释药时滞 仅通过改变内衣层瓜尔胶的厚度，并且不同厚度的瓜尔胶层在结肠微菌群的 作用下均能迅速释药，使药物富集于结肠局部，发挥更好的治疗作用。

单纯的pH敏感型结肠定位释药系统虽然制备简单，但由于人胃肠道的 生理特点，药物到达结肠前即会大量释出，这会造成药物的全身吸收增加、 结肠病变部位药物浓度不足，导致治疗的失败。本文以EudragitFS30D/瓜尔 胶双重包衣技术制备的结肠定位释药小丸采用pH敏感-酶促发两种机制共同 控制药物的释放，使药物可以更安全、有效地靶向于结肠释放。

瓜尔胶的水凝胶性质可以在一定的程度上阻碍药物的释放但阻滞能力有 限。本部分将惰性包衣材料乙基纤维素（ethylcellulose，EC)引入瓜尔胶层， 利用它的疏水性，延长释药时滞，同时瓜尔股依然通过酶促机制释药。控制 瓜尔胶和乙基纤维素的比例及包衣厚度实现延迟释药5 h。

时间依赖-酶促发双重控制结肠定位释药小丸的设计原理为：瓜尔胶为水 溶性高分子材料，乙基纤维素为疏水性高分子材料，将二者混合后作为包衣 材料对载药小丸进行单层包衣。其中瓜尔胶扮演着衣层中的亲水通道，乙基 纤维素则为疏水阻滞屏障。当小丸进入水性环境后，包衣层中的瓜尔胶逐渐 被润湿，形成亲水凝胶通道，释放介质经此通道向丸芯慢慢渗入，一定时滞 后（5h左右），载药丸芯被润湿，药物沿亲水通道释出，即小九口服后约经5 h到达回盲部开始释药。当小丸进入结肠后，在菌群的酶解作用下，瓜尔胶 被水解，药物自九芯释出的屏障减少，释药速度加快。 

第三幸5-氟尿嘧啶时间依赖-酶促发双重控制小丸

一.材料与仪器

1.材料

5-氟尿嘧啶载药丸芯本文第一章制备

瓜尔肢（5200 ~ 5500cps )法国Rhodia公司

乙基纤维素水分散体（Surelease®E-7-19010)英国Colorcon公司

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg) 5-溴尿嘧啶（5-BU,内标）Fluka Biochemika Sigma公司

曱醇（色谱纯）Merck公司

用于HPLC的试剂为色谱纯，盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠等其他试剂均为

分析纯 2.仪器

JGM-H50气流粉碎机 UV-2401PC型紫外分光光度计 BS210S电子天平 BS610S电子天平 85-2型恒温磁力搅拌器 微型流化包衣设备 益森牌离心式单相又流鼓风机 DDB-320多功能电子蠕动泵 ZRS-8G智能溶出仪 S-520扫描电子显微镜华东理工大学 曰本岛津 Sartorius Sartorius

上海智威电器有限公司 自制

浙江温岭市潘郎鼓风机厂 宁波石浦海天电子仪器厂 天津大学无线电厂 曰本Hitachi公司

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪美国安杰伦公司

(G1322ADEGASSER, G1311A QuatPump, G1313A ALS, G1315B DAD) XW-80型旋涡混合器上海超声波仪器厂

3.动物

Beagle 犬，3，8.0±2.0kg,普通级上海市新冈实验动物场

.实验方法

1.体外分析方法的建立（与第一章相同）

2.1瓜尔肢-乙基纤维素混合包衣液的配制

称取适量瓜尔肢，用乙醇分散，搅拌下加入蒸馏水，形成4% (W/V)瓜 尔胶在醇/水（1/4, V/V)体系中的混悬液。然后加入一定量的Surelease,挽 拌均匀后即得瓜尔胶和乙基纤维素的混合包衣液。

2.2小丸包衣

载药小丸10g加到自制微型流化床中，喷嘴直径为0.8mm，控制出口温 度为33±2°C,喷液速率为l.Oml/min,在固定的风量和雾化压力下进行喷液 包衣，直至达到预设的包衣增重。包衣过程中需要连续挽拌包衣液。小丸包 衣完成后，将小丸置于60°C的烘箱中干燥6h。

2.3释放度试验

按转篮法测定，余下操作同第一章实验方法中3.1.3项下所述。除非另有 说明外，释放介质均为PH6..5PBS，在pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶 (0.00968U/ml)来模拟在体结肠的酶解环境。

2.4影响释药的因素 2.4.1释药介质pH的影响

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS4 种释放介质对

瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸释放度的影响。

2.4.2瓜尔股-乙基纤维素比例及包衣增重的影响

瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸的释药行为受包衣处方中瓜尔胶与乙基纤 维素比例和包衣增重影响，以瓜尔肢与乙基纤维素的比例（A)和包衣增重 (B )为因素，以T5和丁9〇 (药物释放5%和90%所需要的时间）为效应，进 行析因设计/效应面优化，筛选较优处方。因素水平及析因实验安排见表3.1。

Tab.3.1 Factors and levels table of 3X4 factorial design for optimizing preparation method of

GG-EC mixed coated pellets.

AGG:ECB Coat weight gain

B! 100%B2 200%B3 300%B4 400%

Ai1/1A,B,Ai B2A,B3Ai B4

A21/2A2B,A2 B2A2 BJA2B4

A31/4A3B,A3B2A3 B3A3 B4

在pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.00%8U/ml)来模拟在体结肠的 酶环境，考察较优包衣处方小丸在其中的释药行为。

3.扫描电镋观察

分别在扫描电镜下观察瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸、瓜尔胶包衣小丸和 乙基纤维素包衣小丸的表面形态及在释放度试验中瓜尔胶-乙基纤维素包衣 小丸的表面形态。

4.体内分析方法的建立（同第一章）

5.瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸在犬体内的药物动力学研究

5.1研究对象

Beagle 犬 5 只，8.0±2.0kg,普通级

5.2试验制剂与参比制剂

受试制剂：GG-EC包衣小丸，GG:EC=1:2,包衣增重405%。

参比制剂：载药小丸 5.3试验设计 服药方法：

采用自身对照交叉试验设计，洗净期为1周。5只犬，禁食过夜（18h), 次曰清晨空腹给药(含5-FU50mg),用10ml水灌胃《由于本章的瓜尔胶-乙基 纤维素包衣小丸和本文第一章中的Eudragit FS30D/瓜尔肢双重包衣小丸的犬 体内药物动力学研究均以5-FU载药小丸为参比制剂，因此两部分药物动力学 试验一起完成。服药方案见第一章表1.1 (p23)。

血样采集：

于服药前后设定的时间从前肢静脉取血1.2ml,置于肝素钠离心管中， 8000rpm离心lOmin ,取上清血桨于-20°C冷冻保存，待分析。

服用栽药小丸的取样时间点：5min、15min、30min、45min、lh、1.5h、 2h、 3h、 4h、 5h、 7h、 9h„

服用瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸的取样时间点：lh、2h、3h、4h、5h、 6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h

样品分析方法：用本文第一章建立的HPLC法测定血浆中的5-FU浓度。 5.4数据处理

直接读取*Tmax，并用t检验法对两参数进行方差分析（其中Cmax 经对数转换）。

3.结果与讨论

1•体内、外分析方法的评价（同第一章）

2.1包衣液处方的选择及配制和包衣小丸的制备

在瓜尔胶衣层中引入水不溶性包衣材料，来延长小丸的释药时滞至5h左 右。基于瓜尔胶包衣的口服结肠定位释药系统，常用的水不溶性包衣材料有醋酸纤维素、乙基纤维素和渗透型丙稀酸树 脂（EudragitRL、EudragitRS、EudragitNE) [1]。乙基纤维素形成的衣膜在 水中的通透性最小，因此本文以它作为混合衣层中的疏水性高分子材料。

瓜尔肢和乙基纤维素的溶解性质相反：乙基纤维素不溶入水，溶于乙醇、 丙酮、异丙醇等多数有机溶剂，而瓜尔胶仅在水中溶解，不溶于任何有机溶 剂。若采取有机溶剂包衣，瓜尔肢完全呈分散状态，包衣过程中易与乙基纤 维素的有机溶液分离，干燥后成粉而导致包衣效率低，且会引起衣层中瓜尔 胶和乙基纤维素的比例发生改变。为此采用水性包衣工艺，将乙基纤维素的 水分散体Surelease和瓜尔胶水/醇体系的混悬液直接混合（见第一章），搅拌 均匀后即可用于小丸的包衣。

Surelease的最低成膜温度（MFT)为23°C,理想的包衣温度为34-38°C[2]， 因此混合包衣的操作温度控制在出口溫度为33±2°C，高于瓜尔胶单独包衣的 操作温度。

2.2释药影响因素 2.2.1.释药介质pH的影响

瓜尔股-乙基纤维素混合包衣小丸（GG:EC=1:2，包衣增重为419%)在 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 中的释放曲线如图 3.1。4 条曲线两两间的f2均大于80，表明包衣小丸的释药速率不受释放介质pH值 的影响。5-FU在4种介质中的溶解度近似（约为18mg/ml),包衣材料瓜尔 胶和乙基纤维素对pH无选择性，因此5-FU从瓜尔肢-乙基纤维素包衣小丸 中的释放程度和速度仅和包衣处方中乙基纤维素的比例和衣层的厚度有关。 为简便起见，本章中的释放度试验均选用PH6.5PBS作为释放介质。

2.2.2瓜尔胶和乙基纤维素的比例及包衣增重对小丸释放度的影响

根据析因实验设计制备的包衣小丸的释药曲线分别见图3.2、3.3和3.4。 从图中可以看出，12种处方的小丸均具不同长短的释药时滞，并且药物延迟 释放的时间随着乙基纤维素在衣层中所占比例的增大及衣层厚度的增加而增

加。

表3.2为析因设计-效应值表。以Statistica 6.0为统计软件，分别按多元 线性方程yH^o+b^x丨+b2x2和多元非线性方程y^bo+b^+b^ +b3x12+b4x22+ b5x :Jx2拟合。

Time (h)

Fig3.1.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:2, CWG419%) in O.lmol/L HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 phosphate buffer

Fig3.2.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:1) with different coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Time (h)

Fig3.3.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:2) with ditferent coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Time (h)

Fig3.4.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:4) with different coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Tab. 3.2 Experimental design table (columns 1-3) with experimentally determined values of different dependent variables (columns 4-5)

Formulation

No.GG:EC

XiCoat weight gain

x2T5

(h)丁90

(li)

11/1111%0.62.0

21/1208%1.12.6

31/1314%1.73.4

41/1438%2.35.2

51/2100%2.05.2

61/2200%3.46.7

71/2313%4,51.1

81/2419%5,59.8

91/4100%3.08.5

101/4198%4.010.1

111/4318%6.013.9

121/4401%8.116.0

T5 and T90 were calculated by interpolating data of each individual release profile.

各效应对两因素各水平的回归方程分别如下：

多元线性:

T5 : y= (3.868286) + (-5.24388)* Xj + (1.025249)*x2(r=0.9544669)

T9〇 : y= (10.13396) + (-11.5362)* x, + (1.610443)*x2(产0.9579517)

多元非线性：

T5 :y= (2.436130) + (-4.48829)=^ + (1.828711)*x2+ (2.325300)* x!2

+ (0.009615)* x22+ (-1.42958)* x !x2(r=0.9890579)

T9〇:y= (12,681484) + (-25.508375)*x1 + (1.8738723)*x2 + (15.01217)*X!2

+ (0.1824542)*X22+ (-2.0470277)*X!X2(r=0.9950415)

其中，y代表T5和T9〇，x!*x2代表瓜尔胶-乙基纤维素的比例和包衣增 重两因素。二项式拟合效果更为理想。对二项式中的6个系数进行方差分析 (ANOVA)通过t检验在p<0.2水平上拒绝某些系数，简化方程。效应T5 和T9Q简化前后的各系数值表分别见表3.3、3.4、3.5和3.6

Tab.3.3 Parameters of Ts valued by nonlinear binomial.

bOblb2b3*b4*b5

Estimate2.436130-4.488291.8287112.3253000.009615-1.42958

Std.Err.L0751712.938030.6035922.1740450.1153600.34800

t(6)2.265808-1.527653,0297151.0695730.083348-4.10800

p-level0.0640350.177460.0231060.3259400.9362860.00630

r=0.98906;* p<0.2 rejecting the hypothesis

Tab.3.4 Parameters of T5 after simplified.

bOblb2b5

Estimate1.680228-1.539661.869726-1.41320

Std.Err.0.6097260.922210.2159970.32033

t(8)2.755713•1.669538.656245-4.41175

p-level0.0248390.133560.0000250.00225

r-0.98695

Tab.3.5 Parameters of T90 valued by nonlinear binomial.

bOblb2b3b4*b5

Estimate12.68148-25.50841.87387215.012170.182454•2.04703

Std.Err.1.447783.95620.8127702.927480.1553390.46860

t(6)8.75926-6.44762.3055395.128011.174557-4.36839

p-level0.000120.00070.0606380.002160.2846730.00473

r=0.99504;* p<0.2 rejecting the hypothesis

Tab.3.6 Parameters of T90 after simplified.

bOblb2b3b5

Estimate11.81977-25.6591 2,75740614.90504-1.92296

Std.Err.1.281524.0600 0.3160473.004350.46875

t(7)9.22322-6.3200 8.7246604.96115•4.10227

p-level0.000040.0004 0.0000520.001640.00456

r=0.99390

因此简化的方程分别为

T5 : y = (1.680228)+ (-1.53966)*XI + (1.869726)*X2+(-1.41320)* X!X2 T9〇: y = (11.81977) + (-25.6591)^! + (2.757406)*x2+ (14.90504)*Xl2 + (-1.92296)*X1X2

根据简化后的二项式拟合描绘各效应对两因素的效应面，见图3.5和图 3.6。由图可知几和！^随EC比例的增加和包衣增重的增大而增大，要实现 安全转运药物至结肠的目的，基于瓜尔胶包衣的口服结肠定位释药系统，应满足T产5h。为了考察瓜尔胶-乙基纤维素混 合衣层对结肠内瓜尔胶水解酶的敏感性，应用Statistic6.0描绘各效应面的等 高线，将各等高线重合（图3.7)，在丁5>511区域内(图3.7中黑线左上方区域) 确定不同T9〇的3个处方：GG: EC为1:2，包衣增重400%、GG: EC为1:4, 包衣增重300%和GG: EC 1:4，包衣增重400%进行下一步研究。 

Fig3.6 The predicted response surface of T90 as a function of the percentage of the radio of GG/EC

and coat weight gain.

Fig3.7 Overlapping figure of the contour plots of Fig3.3〜3.6.

按优选处方制备包衣小丸，进行释放度考察，对预测结杲进行验证，结 果见表3.7。由表3.7可知3种处方的实际值和预测值的偏差均小于10%,因 此采用析因设计-效应面优化法筛选处方具有较好的预测效果。

IndexObserved valuesPredicted valuesDeviation

T55.105.62-9.25%

GG:EC=1:2,405%

T909.76-2.30%

T55.755.89-2.38%

GG:EC=1:4, 303%

丁9012.00-9.29%

T57.807.474.42%

GG:EC=1:4, 407%

T9016.2515.604.00%

2.2.3半乳甘露糖苷酶对瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸释放度的影响

首先考察GG:EC ( 1:2 )，包衣增重405%、GG:EC (1:4 )，包衣增重303% 和GG:EC (1:4 )，包衣增重407% 3种处方的小九经过胃和小肠的转运进入结 肠后经酶促释药的速度。由于瓜尔胶-乙基纤维混合包衣小丸的释放度与介质 的pH值无关，方便起见，以pH6.5PBS5h作为结肠前的释放介质。5h后在 PH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.00%8U/ml)来模拟在体结肠的酶环境。

3种包衣处方小丸的释放度结果见图3.8、图3.9和图3.10。从图中可看 出每种包衣小丸在含酶的释放介廣中的释药速度均有一定程度的加快。由于 包衣层中引入乙基纤维素，瓜尔肢含量降低，因此瓜尔胶-乙基纤维素的混合 衣层对酶的敏感度降低。与本文第一章中包衣增重为580%的瓜尔胶包衣小 丸相比，包衣增重405%的GG-EC( 1:2)混合包衣小丸、包衣增重303%的 00祝（1:4)混合包衣小丸和包衣增重407%的0。疋(：（1:4)混合包衣小 丸进入模拟结肠的释放环境lh后的释药量分别为13.68°/。、7.71%和1 %,远 低于瓜尔胶包衣小丸65 %的释药量。

图3.10显示，与增重303%的GG-EC( 1:4)包衣小丸和增重405%的GG-EC (1:2)包衣小丸相比，增重407%的GG-EC( 1:4)包衣小丸的释药时滞约为 7h左右。最初的设想是希望包衣小丸有足够长的释药时滞（>5h)，但在进入 含酶的环境中能够很快开始释药，即大于5h的时滞可以避免由于胃和小肠转 运时间的变异引起的药物提早释放，而衣层中瓜尔胶对酶的敏感性可以使过 长的释药时滞在进入结肠后失效，药物经酶促发机制开始释放并且以更快的 速度释出。然而图3.10的结果表明这种设想未能实现。小丸在经过前5h(胃、 小肠转运）的释放后进入含瓜尔胶水解酶的人工结肠液，酶的存在并未终止 过长的释药时滞，酶促发药物释放直到8h之后才开始。

图 3.8 (GG:EC = 1:2，包衣增重 405%)和图 3.9 (GG:EC = 1:4,包衣增

o o

6 4

P3S«3I<U.I luuaidOM

20

重303%)表明，两种小丸均有5 h左右的释药时滞，进入含酶的释放介质后， 瓜尔胶水解，药物的释出加快。尽管2种小丸的释药时滞相当，但由于瓜尔 胶和乙基纤维素的比例不同，二者在时滞之后的释药速度不同。GG:EC为1:2 的包衣小丸的衣层增重（405 % )显著大于GG:EC为1:4的包衣小丸（303% )， 但进入瓜尔胶水解酶的环境中的释药速度更快，5 h内释放完全，而后者需要 11 h才能释放完全。因此选择GG: EC为1:2,包衣增重为405%的小丸作为 最优处方进行体内验证。

024681012

Time (h)

Fig.3.9.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG: EC=1:4) in pH6.5

phosphate buffer. 

80 1

60

40

20

 

2.3讨论 2.3.1瓜尔胶-乙基纤维素混合衣层阻滞药物释放的效果

瓜尔胶对药物有一定的阻滞作用，但单独使用无法满足OCDDS 5h的释 药时滞。将水不溶性包衣材料乙基纤维素引入瓜尔胶衣层后，混合衣层阻滞 药物释放的能力明显增强。当乙基纤维素达到一定的比例，混合衣层可以延 迟5h释放药物，实现靶向于结肠释药的目的。图3.11将包衣增重接近的瓜 尔胶包衣小丸（第一章）和不同比例的瓜尔肢-乙基纤维素混合包衣小丸（本 章）在pH6.5PBS中的释放曲线集中起来，更为直观地展现了乙基纤维素对 药物的阻滞作用。

Fig,3.11 .Release profiles of 5-fluorouracil from GG coated and GG-EC mixed coated pellets with different ratio of GG against EC in pH6.5 phosphate buffer. 

2.3,2瓜尔胶-乙基纤维素混合衣层的性质

大多数水分散体需要通过包衣后的热处理工艺来促成衣膜的完全愈合， 但对于乙基纤维素的水分散体Surelease来说，衣膜的愈合可以在包衣过程中 完成[31。由于混合包衣液中的瓜尔胶为混悬液，粒径在300目左右，无法在 包衣过程及通过热处理工艺来促成完整、连续衣膜的形成，因此瓜尔胶和乙 基纤维素混合衣层不是连续的衣膜。分别在扫描电镜下观察瓜尔胶包衣小丸、 瓜尔胶-乙基纤维素混合包衣小丸和乙基纤维素包衣小丸的表面形态，结果如 图3.12所示。由于引入了乙基纤维素，混合衣层的连续性要优于瓜尔胶衣层, 但明显不如乙基纤维素衣膜。

2_3.3包衣小丸释药机制

图3.13展示了释放度试验进行至第4h时瓜尔胶-乙基纤维素混合包衣小 丸的形态，可以看出乙基纤维素形成难溶性的骨架，瓜尔肢形成亲水通道， 药物通过此通道释出。瓜尔胶在衣层中的比例决定着亲水通道的多少，包衣 层的厚度决定着释放介质到达栽药丸芯所要克服的路径，这两者共同决定了 最终的释药时滞时间3另外瓜尔胶在衣层中所占的比例也决定着时滞后药物 的释药行为。瓜尔胶比例越高，衣层的酶敏感性越强，进入结肠后经酶促发 的药物释放更迅速。

由于混合包衣材料中的瓜尔胶除了具备高度的亲水性外，还可以被结肠 内微菌群产生的酶特异性降解，因此存在于释放环境中的酶可以成为促使药 物开始释放的诱因。但是这一诱因能否成功促发药物释放还依赖于释药系统 对水的通透性。系统对水的通透性高，酶才可以逐渐深入释药系统水解瓜尔 胶，释出药物。这与文献报道的生物可降解型OCDDS所采用材料的亲水性 的好坏决定着菌群能否有效地对其进行消化，引起/加快药物释放的结论一致 [4_7]。本研究的初衷是控制释药时滞大于5h,进入结肠后经菌群促发而释药， 这样可以避免胃肠道转运时间变异引起的结肠定位释药不准确。但研究结果 (图3.10)表明酶进入释药系统水解瓜尔胶引发药物释放的时间与自身的释 药时滯一致。这表明包衣层中的瓜尔胶被水润湿形成亲水通道延伸至栽药丸 芯时药物开始释出，瓜尔肢水解酶随着亲水通道的形成进入给药系统，伴随 药物释出的开始发挥酶解作用，在释药时滞后加速了药物的释放。

3.瓜尔肢-乙基纤维素混合包衣的5-FU小丸犬体内药物动力学评价

犬口服5-FU载药小丸、瓜尔胶-乙基纤维素混合包衣小丸的血药浓度数 据分别见表3.8和表3.9,平均血药浓度-时间曲线图见图3.14,药动学参数见 表 3.10。

Tab3.8 plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of uncoated pellets (n=5)

TimeNo. of subjectsX 土 SD

(h)12345

0000000

0.0833044.40028.2129.5220.43士 19.70

0.25138.22160.6229.64152.23122.43160.63土 41.21

0.5319.50366.6317.93318.96336.99331 別土 20.64

0.7590.2385.8255.6885.02130.1889.39土 26.61

128.7323.85021.3666.7728.13 土24.21

1.5000025.615.55 士 11.21

2000000

2.5000000

3000000

4000000

5000000

7000000

9000000

Tab3.9 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of GG-ECcoated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

000000

100000

200000

300000

400000

5030.43000

633.220063.720

70084.36051.36

800000

1000000

1200000

2400000

Tab3.10 Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of 5-fluorouracil in beagle dogs (n=5) after oraladministration of (dose 50 mg) of 5-FU formulations.

parametersUncoated pelletsGG-EC mixed coated pellets

Cmax (ng/ml)332.00±20.8952.62土 20.01 *

Tmax (h)0.50±0.006.20±0.75 *

vs uncoated pellets, at P<0.01

从结果可以看出2种小九体内行为有着显著的差异。与载药丸芯相比， 瓜尔胶-乙基纤维素混合包衣小丸的丁^为6.2h明显长于载药丸芯（0.5h)， (：_为52.62ng/ml远低于载药丸芯（332.00ng/ml),表明瓜尔胶-乙基纤维素 包衣小丸可在体内延迟药物释放。

与本文第一章中的Eudragit FS30D包衣小丸和Eudragit FS30D/瓜尔股双 层包衣小丸一样，瓜尔胶-乙基纤维素包衣小丸在犬体内只测得一个时间点的 血药浓度，因此在图3.14中仅对载药丸芯做药-时曲线图，而对瓜尔胶-乙基 纤维素包衣小丸则以不同时间下实际检出的平均血药浓度柱状图表示药物进 入体循环的时间及浓度。从图3.14可以看出：与速释栽药丸芯相比，瓜尔胶 -乙基纤维素包衣小丸可显著延缓药物释放，口服包衣小丸5-7h后，药物进 入体循环，与体外5h左右的释药时滞接近，说明混合衣层可以保护药物安全 通过胃及小肠，到达结肠后才开始释放药物，因此瓜尔胶-乙基纤维素包衣小 丸显示出较好的结肠靶向性。 

111/211〕s-q Jo 120^5S3!IS

-HI?—uncoated pellets O GG-EC coated

 

Fig.3.14 Mean plasma concentration-time profiles of 5-fluorouracil (dose 50 mg) following oral administration of uncoated pellets and GG-EC mixed coated pellets(GG: EC=1:2, CWG405%) in beagle dogs (n=5).Bars represent standard deviation,

4.小结

本章采取时间控制-酶促发双重策略，将瓜尔肢和乙基纤维素混合后对载 药丸芯进行包衣，通过调节二者的比例及包衣增重即可实现延迟药物释放5h。 体内外试验结果表明当瓜尔肢和乙基纤维素的比例为1:2,包衣增重为405% 时，药物在5h左右的时滞后开始释放，并在酶促作用下更快地将5-FU释出， 药物浓集于结肠局部，显示出较好的结肠靶向性。

瓜尔胶和乙基纤维素混合后在流化床内对小丸包衣，操作简便，释药时 滞可靠。两种性质的高分子材料配比使用，利用混合材料的亲水性/疏水性实 现目标释药时滞，改变了传统时间控制型给药系统采用的凝狡膨张/渗透泵/ 肠溶包衣等多种原理相结合的较为复杂的制备工艺[841]。这种新的延迟释药技 术不仅为OCDDS提供了简便可行的制备方法，同时也为脉冲给药系统提供 了有效可行的新方法。